Diccionario

Variante de la PCR convencional simple que comprende dos rondas de amplificación consecutivas, con distintos pares de cebadores (externos e internos a la secuencia diana), con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el fragmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica. Se efectúa consecutivamente en dos tubos distintos, implicando dicha operación serios riesgos de contaminación, pues supone abrir el tubo con los amplicones de la primera ronda para realizar la segunda ronda de amplificación. Para solventar el problema se han diseñado protocolos en un solo tubo cerrado. La PCR anidada supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de la PCR o RT-PCR convencional.

Procedimiento para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR o RT-PCR anidada o la semianidada en dos rondas consecutivas de amplificación en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación por aerosoles al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. Para solventar este problema, se desarrolló un sistema para la separación física de los cebadores externos e internos dentro de un mismo tubo, mediante el uso de la parte final de una punta de pipeta de 100 L en cuyo interior se deposita el segundo cóctel y donde se mantiene por capilaridad. Esta estrategia permite realizar las dos amplificaciones sin abrir o cambiar de tubo. Transcurrida la primera amplificación, es suficiente agitar levemente el tubo para que el segundo cóctel se mezcle con el resultado de la primera amplificación y, sin abrir el tubo, comience la segunda amplificación. La PCR anidada en un solo tubo cerrado supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de PCR o RT-PCR convencional y es interesante cuando no se dispone de otras opciones como PCR en tiempo real. También puede efectuarse la versión RT-PCR en un solo tubo cerrado.

Cada una de las secuencias de ADN usada para amplificar ADN en una primera ronda de PCR anidada seguida por una segunda que utiliza cebadores complementarios a la secuencia de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera ronda de PCR (cebadores internos). Los productos de amplificación de la primera PCR constituyen el molde para la segunda amplificación.

Cada una de las secuencias de ADN complementarias a una secuencia de ADN ya amplificada por PCR anidada en una primera ronda de amplificación con el uso de cebadores externos o aquel cebador único utilizado en la segunda ronda de una PCR semianidada.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Método de PCR basado en la acción simultánea y coordinada de cuatro cebadores, que permite la detección de bacterias y virus de ARN, viroides y otros ARN transcritos, en su variante de RT-PCR. La reacción tiene lugar en un único cóctel y en un solo tubo cerrado. En el caso de RT-PCR, la transcripción reversa y simultánea de los fragmentos, la coordinación entre cebadores externos e internos y la cooperación de los amplicones a modo de cebadores o iniciadores son la base del método. Su sensibilidad es similar a la del PCR y RT-PCR anidada, que resulta ser 100 veces mayor que la obtenida con PCR o RT-PCR simples y utiliza 10 veces menos reactivos. Es una opción económica si no se dispone de termociclador para PCR en tiempo real. También puede realizarse la versión RT-PCR cooperativa.

1. Aislamiento de un área específica de tejido mediante una barrera de tejidos del huésped o anfitrión. 2. A diferencia de la célula procariota, que generalmente consta de un solo compartimiento rodeado por la membrana plasmática, la célula eucariota está subdividida en compartimientos rodeados por membranas, que son funcionalmente distintos. Cada compartimiento u orgánulo (u organela) contiene su propia dotación de enzimas, otras moléculas especializadas y un complejo sistema de distribución que transporta específicamente los compuestos de un compartimiento a otro. Por lo tanto, la compartimentación, o subdivisión celular en compartimientos, conduce a la especialización funcional. 3. Efectuar una separación en un recipiente o tubo de reacción (tipo Eppendorf) para realizar reacciones independientes en el mismo tubo.

La PCR o RT-PCR semianidada utiliza dos cebadores externos y un único cebador interno. Este procedimiento permite aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR simple convencional. Generalmente, las amplificaciones se realizan en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. La versión RT-PCR semianidada es muy utilizada.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa o reversa. Técnica de laboratorio comúnmente utilizada para generar copias de ADN partiendo de dianas de ARN. Se usa una enzima llamada retrotranscriptasa que convierte un segmento específico de ARN en un fragmento complementario de ADN. Luego, otra enzima llamada ADN polimerasa amplifica (produce en grandes cantidades) ese segmento de ADN. En el caso de que se utilice la técnica para evaluar actividad de transcripción, las copias de ADN amplificadas ayudan a identificar si hay un gen que produce la molécula específica de ARNm. Es posible usar la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción para detectar ciertos cambios en un gen o cromosoma, o para identificar la activación de ciertos genes, lo que ayuda a diagnosticar enfermedades, y para el estudio del ARN de ciertos virus (la gran mayoría de virus fitopatógenos poseen genoma de ARN). Posee las mismas variantes de reacción que la PCR.