Diccionario

1. Aumento de la transcripción del ADN mediante la unión de una molécula específica al ADN. 2. Muestra que contiene el analito, agente, componente, etc. que se desea medir en una concentración detectable, o experimento paralelo en el que se espera una reacción positiva.

Técnica de inmovilizado de dianas de agentes patógenos en un soporte sólido (membrana de papel, nitrocelulosa, éster de celulosa, nailon, etc.) para su posterior detección mediante pruebas inmunológicas, de hibridación o especialmente de amplificación molecular (PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real o isotermas). Se presiona hasta aplastar directamente el material vegetal en el soporte sólido durante unos segundos o al posible vector, con ayuda en este caso, del fondo redondeado de un tubo de plástico o vial. Se puede realizar en campo o laboratorio por personal no especializado en métodos de detección o diagnóstico. Las dianas impresas pueden ser conservadas en un lugar oscuro y seco durante meses antes de su análisis o ser remitidas por correo a temperatura ambiente hasta un laboratorio para su procesado. Su uso no implica problemas cuarentenarios y suele ser empleado en pruebas interlaboratorio y como control positivo o negativo (material vegetal certificado sano), en algunos kits de diagnóstico y detección.

Proceso de conversión de los valores brutos de una prueba para cada muestra problema en unidades de actividad respecto al estándar o estándares de trabajo. Los valores normalizados se pueden expresar de muchas maneras, como en porcentaje respecto al valor de un control positivo (como en una prueba ELISA), o como una concentración o título de un analito derivado de una curva estándar, o como un número de copias genómicas de la diana también derivadas de una curva estándar de valores Ct (umbral del ciclo) para PCR en tiempo real. Es una buena práctica incluir estándares de trabajo (o por lo menos una muestra razonablemente bien caracterizada) en todas las realizaciones durante el desarrollo y validación de la prueba, ya que esto permite una normalización de los datos, lo cual proporciona un medio válido para la comparación directa de los resultados entre las distintas ejecuciones de una prueba. Los sistemas automáticos de análisis permiten calcular y obtener estos datos mediante una curva estándar, o bien obtener el número del ciclo a partir del cual se está excediendo el umbral de ciclos, como en la PCR en tiempo real.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

En el ámbito de la Sanidad Vegetal, material, organismo o microorganismo, producto o subproducto de origen biológico generado en diversas actividades, como durante operaciones de detección, diagnóstico o identificación, que puede contener o vehicular agentes nocivos para las plantas. Estos agentes nocivos pueden incluir, entre otros: agentes patógenos, incluyendo los utilizados como control positivo; vectores; material vegetal infectado o potencialmente infectado, infestado o contaminado; substrato o suelo y sus contenedores, bolsas o macetas; medios de cultivo; muestras; reactivos biológicos; o desechos y materiales derivados de análisis, tratamientos o pruebas experimentales de patogenicidad. Requiere gestión y eliminación segura para evitar la diseminación de organismos nocivos y la contaminación ambiental, agrícola o forestal, tras su uso experimental. No existe el término jurídico único para “residuo biosanitario” para plantas, pero su gestión se deriva de varias normas sectoriales de la Unión Europea (UE), como: i) la Directiva 2008/98/CE (Marco de Residuos), que define los residuos biológicos y obligaciones generales de gestión y trazabilidad; ii) para sanidad vegetal y agentes nocivos: Reglamento (UE) 2016/2031 que dicta las bases del sistema fitosanitario europeo e incluye el control y confinamiento de organismos nocivos, y el reglamento de Ejecución (UE) 2019/2072 donde se dictan las medidas para contener/eliminar material vegetal contaminado; y iii) relativo al trabajo experimental con organismos nocivos, existen directrices de bioseguridad y confinamiento en laboratorios de fitopatología (EPPO normas PM 3 & PM 7). Las normas PM 3 se centran en los procedimientos de inspección y medidas fitosanitarias en el campo y en el comercio, mientras que las normas PM 7 se centran en los protocolos de laboratorio y diagnóstico para la identificación precisa de plagas, en sentido amplio. La normativa específica española lógicamente está totalmente alineada con la de la UE, pero además detalla en el Real Decreto 553/2020, el traslado de residuos dentro del territorio español, y la Ley 43/2002, de Sanidad Vegetal indica la gestión de organismos nocivos y materiales contaminados. Además, existe normativa autonómica en distintas CC. AA. del Estado español para la gestión de residuos biosanitarios, aplicable en laboratorios oficiales y centros de diagnóstico vegetal. En la práctica, los residuos biosanitarios fitopatológicos se asimilan a residuos sanitarios humanos y de tipo biológico/infeccioso, aunque su origen sea vegetal. Se diferencia de residuo fitosanitario porque este último se refiere a restos químicos de plaguicidas y el residuo biosanitario es biológico.

1. Aquel que contiene el analito, agente patógeno o sus componentes en una concentración superior a un límite especificado, por lo cual se espera del mismo una reacción, respuesta o comportamiento en unas condiciones dadas y, por ello se introduce en el experimento o prueba. 2. Introducción de un experimento paralelo que garantice reacción. Implica generalmente el uso de un tratamiento alternativo que se espera y sabe tendrá un efecto sobre la variable dependiente. Significa que en el experimento o prueba se obtiene un resultado positivo, cuando era lo esperable y garantiza el correcto funcionamiento del método, protocolo y reactivos utilizados en la prueba.