Diccionario

Sigla de nucleósidos trifosfato. Que contienen desoxirribosa como azúcar y son componentes básicos del ADN.

Técnica de amplificación molecular isotérmica muy sensible, específica y selectiva, que se basa en la utilización de tres proteínas: una recombinasa, una proteína de unión a ADN monocatenario (proteína SSB, o single-stranded DNA-binding protein) y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra (strand displacement). La recombinasa forma un complejo nucleoproteico con el cebador en presencia de ATP y de un agente concentrador, como polietilenglicol; este complejo se une a la secuencia de ADN homóloga al cebador y favorece la desnaturalización local del ADN. Las regiones de cadena única se estabilizan mediante unión de la proteína SSB y, al disociarse la recombinasa del ADN, la ADN polimerasa se une al extremo 3’ del cebador e inicia la síntesis de ADN en presencia de dNTPs. La repetición cíclica de este proceso da lugar a una amplificación exponencial del ADN a una temperatura de 37–42 °C, sin requerir ciclos térmicos como la PCR. La técnica es robusta, pues puede amplificar con una preparación mínima de la muestra y permite utilizar extractos crudos, brutos o muy poco procesados. Permite producir una cantidad detectable de ADN amplificado en unos 20 minutos y partiendo de 1–10 copias del ADN diana. Se ha utilizado para amplificar ARN, ARNmi, ADN monocatenario (ssDNA) y ADN bicatenario (dsDNA) de una amplia variedad de organismos y muy distintas muestras. Se utiliza en detección de agentes fitopatógenos, genómica y biotecnología. Esta técnica, para detección del oomiceto Phytophthora pini, se ha combinado con un sistema de detección visual mediante un dispositivo de flujo lateral, lo que permite identificar la presencia del patógeno de forma sencilla. Combinado con CRISPR-Cas12a, conocida por su capacidad de edición genética y detección de secuencias específicas de ADN, permite la detección precisa, con alta sensibilidad, de secuencias diana.

Mezcla que contiene todos los componentes necesarios para una reacción de amplificación molecular mediante PCR. Disponible comercialmente este producto está diseñado para disminuir tiempos en la preparación de la reacción de PCR y evitar contaminaciones en las etapas de pipeteo. Es una solución premezclada en agua destilada libre de ADNasas y que contiene ADN polimerasa Taq, dNTPs, MgCl2 y tampones de reacción en concentraciones óptimas para una amplificación eficiente de las dianas de ADN mediante PCR.

Subunidad estructural de ácidos nucleicos. Compuesto que consta de una base nitrogenada unida covalentemente a un azúcar pentosa. En los nucleósidos biológicamente más importantes, el azúcar puede ser ribosa (ribonucleósidos) o desoxirribosa (desoxirribonucleósidos), y el compuesto que contiene nitrógeno es una pirimidina (citosina, timina o uracilo) o una purina (adenina o guanina). El nucleósido es el precursor del nucleótido, pues puede combinarse con uno o más grupos fosfórico mediante quinasas especiales de la célula, produciendo nucleótidos, que son los componentes moleculares básicos del ADN y el ARN Los nucleósidos trifosfato que contienen ribosa como azúcar se abrevian convencionalmente como NTP (son los componentes básicos del ARN, mensajeros químicos o moléculas de transferencia de energía, como el ATP), mientras que los nucleósidos trifosfatos que contienen desoxirribosa como azúcar se abrevian como dNTP (son los componentes básicos del ADN).

Compuesto que consta de una base nitrogenada, un azúcar pentosa y ácido fosfórico. Constituyen las unidades estructurales básicas (monómeros) a partir de las cuales se construyen los polímeros ADN y ARN. Los principales nucleótidos presentes en las células vivas son los que provienen de las purinas adenina y guanina y de las pirimidinas citosina, timina y uracilo. El azúcar es la D-desoxirribosa (en el ADN) o la D-ribosa (en el ARN). Los nucleótidos se encuentran también en la célula como mononucleótidos o dinucleótidos libres: adenina, G para guanina, T para timina, C para citosina, la segunda letra mayúscula indica el número de fosfatos (mono, di, tri) y la tercera letra es siempre P, que significa fosfato. Así dATP, significa desoxirribosa adenosina trifosfato. Los NTP son los componentes básicos del ARN y los dNTP son los componentes básicos del ADN. Se utilizan para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), síntesis de ADNc, síntesis y marcaje de cebadores y de ADN, transcripción in vitro, amplificación isotérmica, clonación, secuenciación de Sanger y secuenciación de próxima generación (NGS), entre otras aplicaciones. Se pueden elegir comercialmente productos individuales (dATP, dGTP, dTTP, dCTP y dUTP) o como una mezcla de las cuatro especies.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).