Diccionario

Técnica de amplificación molecular isotérmica muy sensible, específica y selectiva, que se basa en la utilización de tres proteínas: una recombinasa, una proteína de unión a ADN monocatenario (proteína SSB, o single-stranded DNA-binding protein) y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra (strand displacement). La recombinasa forma un complejo nucleoproteico con el cebador en presencia de ATP y de un agente concentrador, como polietilenglicol; este complejo se une a la secuencia de ADN homóloga al cebador y favorece la desnaturalización local del ADN. Las regiones de cadena única se estabilizan mediante unión de la proteína SSB y, al disociarse la recombinasa del ADN, la ADN polimerasa se une al extremo 3’ del cebador e inicia la síntesis de ADN en presencia de dNTPs. La repetición cíclica de este proceso da lugar a una amplificación exponencial del ADN a una temperatura de 37–42 °C, sin requerir ciclos térmicos como la PCR. La técnica es robusta, pues puede amplificar con una preparación mínima de la muestra y permite utilizar extractos crudos, brutos o muy poco procesados. Permite producir una cantidad detectable de ADN amplificado en unos 20 minutos y partiendo de 1–10 copias del ADN diana. Se ha utilizado para amplificar ARN, ARNmi, ADN monocatenario (ssDNA) y ADN bicatenario (dsDNA) de una amplia variedad de organismos y muy distintas muestras. Se utiliza en detección de agentes fitopatógenos, genómica y biotecnología. Esta técnica, para detección del oomiceto Phytophthora pini, se ha combinado con un sistema de detección visual mediante un dispositivo de flujo lateral, lo que permite identificar la presencia del patógeno de forma sencilla. Combinado con CRISPR-Cas12a, conocida por su capacidad de edición genética y detección de secuencias específicas de ADN, permite la detección precisa, con alta sensibilidad, de secuencias diana.

Técnica serológica que combina un sistema integral de análisis o dispositivo, basado en anticuerpos inmovilizados en una única tira de membrana que posee dos zonas (de conjugado y de captura) y permite la determinación rápida (5-15 minutos) de la presencia o ausencia de un patógeno o sus metabolitos o incluso de diversos analitos, como de dos aislados del mismo virus o de diferentes. Los dispositivos más utilizados en Fitopatología están compuestos por tiras reactivas inmunocromatográficas de nitrocelulosa o éster de celulosa. Para realizar el análisis, se añade una gota de extracto de la muestra o de una suspensión de células del microorganismo por un orificio redondo en la denominada zona de conjugado, mezclada con anticuerpos específicos del patógeno a detectar pero conjugados usualmente con nanopartículas de carbón coloreadas. Si la muestra contiene el antígeno problema, este se unirá a los anticuerpos conjugados formando un complejo que migrará a través de la membrana. Si no, migrarán separados el anticuerpo conjugado y la muestra sin antígeno, sin unirse. En la zona de captura del dispositivo (dos líneas separadas de anticuerpos) se encuentran fijados en una primera línea anticuerpos específicos frente a otro epítopo del antígeno problema. Al llegar la muestra a esta primera línea, los complejos formados por la unión del antígeno (muestra) con el conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso en rosa, negro o azul, según el color del delator (muestra positiva). En el caso contrario, si las muestras son negativas, aparecerá una segunda línea donde los conjugados sin fijarse al antígeno inexistente, quedarán retenidos por anticuerpos anti la especie animal utilizada en la prueba. Así pues, la aparición de dos líneas (positivo y control) indicarán la presencia del patógeno analizado y la aparición de una única línea de control indicará la ausencia del patógeno o su presencia en concentración inferior al límite de detección de la técnica y sus reactivos. Esta evaluación visual permite el análisis cualitativo y semicuantitativo. Mediante un lector especial, se pueden analizar de forma cuantitativa las tiras reactivas. Además de la rapidez de los resultados y la sencilla manipulación, los ensayos de flujo lateral tienen la ventaja de poder ser utilizadas en condiciones de campo por personal no especializado a un coste económico relativamente bajo.