Diccionario

Técnica de inmovilizado de dianas de agentes patógenos en un soporte sólido (membrana de papel, nitrocelulosa, éster de celulosa, nailon, etc.) para su posterior detección mediante pruebas inmunológicas, de hibridación o especialmente de amplificación molecular (PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real o isotermas). Se presiona hasta aplastar directamente el material vegetal en el soporte sólido durante unos segundos o al posible vector, con ayuda en este caso, del fondo redondeado de un tubo de plástico o vial. Se puede realizar en campo o laboratorio por personal no especializado en métodos de detección o diagnóstico. Las dianas impresas pueden ser conservadas en un lugar oscuro y seco durante meses antes de su análisis o ser remitidas por correo a temperatura ambiente hasta un laboratorio para su procesado. Su uso no implica problemas cuarentenarios y suele ser empleado en pruebas interlaboratorio y como control positivo o negativo (material vegetal certificado sano), en algunos kits de diagnóstico y detección.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Inmovilización de agentes patógenos o de parte de sus constituyentes o metabolitos de forma específica o no, con fines de detección o identificación. Se realiza normalmente en el mismo soporte sólido en el que se realiza la reacción inmunológica, de hibridación o de amplificación molecular. Frecuentemente se efectúa por medio de anticuerpos específicos en el caso de inmunoelectromicroscopía.

En Fitopatología, se consideran fáciles de usar y normalmente sencillos de ejecutar, porque no exigen la realización de extractos, purificación de ácidos nucleicos, o tratamiento complejo de las muestras vegetales o de vectores, en su procesado antes del análisis de las mismas mediante técnicas de cultivo o aislamiento, serológicas, de hibridación o moleculares de amplificación.