Diccionario

Existen diferentes sistemas para la detección de la fluorescencia generada durante el proceso de amplificación mediante PCR. Los dos principales son el uso de substancias no específicas que emiten fluorescencia cuando se intercalan entre las dobles cadenas de ácidos nucleicos (SYBR-Green®), o las sondas específicas directamente marcadas con fluoróforos o moléculas fluorescentes (TaqMan®, molecular beacons, Scorpions®, etc.). El SYBR-Green® es un compuesto orgánico de fórmula química C32H37N4S, que forma parte del grupo de las cianinas asimétricas y se une a los amplificados de manera inespecífica emitiendo fluorescencia independiente de la secuencia del DNA, no es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. El complejo resultante ADN-SYBR Green® presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, por ello su denominación). En este caso es necesario realizar un segundo análisis de sus respectivas curvas de fusión para diferenciar los tamaños y composición de las secuencias amplificadas. En cambio, las sondas específicas marcadas con un fluoróforo están diseñadas para hibridar con una región específica del ADN, interna al producto de PCR de un determinado patógeno, alcanzando así la máxima especificidad y sensibilidad.

Tecnología reciente para la preparación de sondas de hibridación de ADN activadas por fluorescencia dirigidas a secuencias de ARNm específicas. Se basa en la conjugación de un intercalador no fluorescente en la base de un ácido nucleico (como uracilo) a través de un espaciador flexible. Este monómero modificado se puede incorporar a los oligonucleótidos mediante síntesis en fase sólida. Se observa una gran mejoría de la fluorescencia cuando el nucleótido modificado se hibrida con su cadena complementaria debido a la intercalación del fluoróforo entre las dos cadenas.

Reemisión en forma de radiación visible de la energía radiante captada por un pigmento. La longitud de onda de la luz emitida es siempre mayor que la correspondiente a la luz absorbida, es decir la radiación tiene menos energía. La liberación de fotones es casi inmediata a su absorción. La vida media de la fluorescencia (tiempo promedio que un fluoróforo permanece en estado excitado después de la excitación), es solo del orden de 10 ns. Los fluoróforos típicos son: quinina, fluoresceína (generalmente en su formulación de isotiocianato de fluoresceína), rodamina, antraceno y perileno.

Cualquier proceso que disminuya la intensidad de la fluorescencia de una muestra. Es muy dependiente de la presión y la temperatura. Varias interacciones moleculares pueden conducir a ello, incluyendo reacciones en estado excitado, reordenamientos moleculares, transferencia de energía, formación de complejos y extinción de los encuentros por colisiones moleculares resultantes entre el fluoróforo y el extintor, lo que se denomina extinción por colisión o dinámica.

Nombre comercial de una sonda de hidrólisis diseñada con el fin de incrementar significativamente la especificidad de la PCR cuantitativa, mediante tecnología de la compañía Roche. Contiene un fluoróforo emisor y un colorante supresor o extintor muy próximos el uno del otro, y cuando la sonda está intacta, el extintor suprime la señal fluorescente del emisor. Durante la PCR, la polimerasa rompe la sonda, separando el emisor y el extintor, permitiendo emitir fluorescencia. Por tanto, el supresor inhibe la fluorescencia del fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del termociclador. De esta forma, mientras que el fluoróforo y el supresor o extintor estén próximos el uno al otro, no habrá señal fluorescente, puesto que el último está ejerciendo su actividad inhibidora.

Marcador que supone una alternativa al bromuro de etidio en electroforesis, pues es más sensible y mucho menos tóxico, pero ha sido sustituido por otros marcadores para PCR. Marca los ácidos nucleicos puros, pero adicionalmente se puede emplear en el etiquetado del ADN dentro de las células para la citometría de flujo y en la microscopía de fluorescencia, tras tratamiento previo con ARNasa, para reducir la cantidad de ARN celular.

Componente de una molécula que hace que esta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molécula que absorbe energía de una longitud de onda específica y la vuelve a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, es decir, con menor energía. La cantidad de energía emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio fluorocromo como de su ambiente químico. Se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los elementos que componen la célula, lo que permite identificar distintas moléculas o conjuntos de moléculas. Puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas, como anticuerpos que específicamente reconocen a antígenos. Así pueden ser utilizados en inmunofluorescencia (para visualizar células bacterianas o fúngicas), en inmunohistoquímica (utilizada en Bacteriología y Virología) o en el análisis o detección de ADN mediante la técnica de PCR en tiempo real. El isotiocianato de fluoresceína, reactivo derivado de la fluoresceína es uno de los fluorocromos más habituales, otros comunes son los derivados de la rodamina, cumarina y cianina. Las nuevas generaciones como el Alexa Flúor o los DyLight Flúor y otros, son generalmente más fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros colorantes estándar de excitación.