Diccionario

Existen diferentes sistemas para la detección de la fluorescencia generada durante el proceso de amplificación mediante PCR. Los dos principales son el uso de substancias no específicas que emiten fluorescencia cuando se intercalan entre las dobles cadenas de ácidos nucleicos (SYBR-Green®), o las sondas específicas directamente marcadas con fluoróforos o moléculas fluorescentes (TaqMan®, molecular beacons, Scorpions®, etc.). El SYBR-Green® es un compuesto orgánico de fórmula química C32H37N4S, que forma parte del grupo de las cianinas asimétricas y se une a los amplificados de manera inespecífica emitiendo fluorescencia independiente de la secuencia del DNA, no es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. El complejo resultante ADN-SYBR Green® presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, por ello su denominación). En este caso es necesario realizar un segundo análisis de sus respectivas curvas de fusión para diferenciar los tamaños y composición de las secuencias amplificadas. Véase también SYBR-Green. En cambio, las sondas específicas marcadas con un fluoróforo (véase también TaqMan®) están diseñadas para hibridar con una región específica del ADN, interna al producto de PCR de un determinado patógeno, alcanzando así la máxima especificidad y sensibilidad.

Reemisión en forma de radiación visible de la energía radiante captada por un pigmento. La longitud de onda de la luz emitida es siempre mayor que la correspondiente a la luz absorbida, es decir la radiación tiene menos energía. La liberación de fotones es casi inmediata a su absorción. La vida media de la fluorescencia (tiempo promedio que un fluoróforo permanece en estado excitado después de la excitación), es solo del orden de 10 ns. Los fluoróforos típicos son: quinina, fluoresceína (generalmente en su formulación de isotiocianato de fluoresceína), rodamina, antraceno y perileno.