Diccionario

Técnica utilizada en la secuenciación automática, en la que rondas sucesivas de desnaturalización, hibridación y extensión en un termociclador específico, dan como resultado una amplificación lineal de los productos de extensión. Estos productos se cargan en un gel o se inyectan en un capilar para la obtención de su secuencia de bases. Las ventajas de la secuenciación cíclica, frente a otras opciones básicamente son: i) sencillez de los protocolos; ii) se requiere menos ADN molde que con los métodos de extensión a una única temperatura; iii) las temperaturas altas reducen considerablemente la estructura secundaria en el ADN así como los sitios secundarios de hibridación del iniciador o cebador; iv) no requiere la etapa de desnaturalización química del ADN de doble cadena; y v) se puede emplear el mismo protocolo para secuenciar ADN de cadena simple, de doble cadena o incluso para la secuenciación directa de amplicones (productos de PCR) de interés.

Aquella que se efectúa de forma automatizada en un secuenciador. La mayoría de los métodos de secuenciación automática utilizados actualmente son modificaciones del método de Sanger. En este método, el ADN que va ser secuenciado funciona como un molde para la síntesis enzimática de un nuevo ADN que comienza en un sitio definido por la unión de un iniciador o cebador. En la reacción se utiliza una mezcla de desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos a unas concentraciones que crean una probabilidad finita de que un didesoxinucleótido se incorpore en lugar del correspondiente desoxinucleótido en cada posición de la cadena que está siendo sintetizada. La incorporación de un didesoxinucleótido bloquea la elongación de la cadena y ello da como resultado una población de fragmentos de ADN truncados de diferente longitud. La identidad del nucleótido que termina la cadena en cada posición se puede determinar: i) realizando cuatro reacciones de elongación separadas, cada una de las cuales con un didesoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP), o ii) con una única reacción de elongación combinando los cuatro didesoxinucleótidos distintos marcados cada uno específicamente. La población de moléculas resultante se separa por tamaños mediante electroforesis en un gel de acrilamida y la secuencia se obtiene correlacionando el orden de los fragmentos en la electroforesis con el didesoxinucleótido que termina cada uno de ellos. Numerosos servicios de secuenciación realizan esta de forma comercial. Una característica de la secuenciación automática que la distingue de la secuenciación manual es la utilización para la extensión de las nuevas cadenas de ADN de una polimerasa termoestable Taq (véase secuenciación cíclica).