Diccionario

Menor cantidad de objetivo o diana que se puede detectar de manera fiable. Se calcula para distintos patógenos según los detalles del documento OEPP PM 7/98 (5), “Requisitos específicos para los laboratorios que preparan la acreditación para una actividad de diagnóstico de plagas de plantas”. En el caso de virus, viroides y fitoplasmas (agentes no cultivables in vitro), se analizan al menos ocho muestras en el límite de detección establecido. Estos resultados se pueden combinar con repetibilidad/reproducibilidad y constituyen un criterio para la validación de una prueba o método analítico.

El rendimiento de las pruebas de detección o diagnóstico se ve afectado por diversos factores, que abarcan desde las primeras etapas del desarrollo hasta la etapa final de evaluación de los resultados cuando la prueba se aplica a poblaciones específicas de plantas o vectores. Una prueba, por lo tanto, no puede ser considerada válida a menos que se hayan comprobado y confirmado, o que haya cumplido un conjunto específico de criterios de validación esenciales, ya sea cuantitativa o cualitativamente. La falta de cumplimiento de cualquiera de estos criterios es probable que reduzca la confianza en que la prueba cumpla los objetivos deseados. Los primeros criterios por lo general se tratan durante la fase de desarrollo de la prueba: i) aptitud para el fin deseado; ii) optimización; iii) normalización; y iv) robustez. Los siete siguientes son evaluados durante las tres primeras etapas de la fase de validación de la prueba: v) repetibilidad; vi) sensibilidad analítica; vii) especificidad analítica; viii) umbrales (puntos de corte); ix) sensibilidad y especificidad diagnósticas; x) reproducibilidad; y xi) solidez.

Aquellas que se han de seguir para su validación, una vez se ha desarrollado el ensayo o test y se ha optimizado y establecido su robustez. Generalmente consta de cuatro etapas secuenciales: i) determinación inicial de sus características analíticas (especificidad analítica, sensibilidad analítica y estimación preliminar de su repetibilidad y reproducibilidad) comparada por el método de diagnóstico o detección estándar para ese patógeno; ii) estimación de sus características diagnósticas con cepas y muestras de referencia y cálculo de la especificidad diagnóstica, sensibilidad diagnóstica y determinación del umbral o punto de corte; iii) Estima de su reproducibilidad y solidez con un conjunto de muestras positivas y negativas (normalmente mitad de ellas positivas y otras tanto negativas) a evaluar entre distintos laboratorios colaboradores; y iv) Implementación, interpretación de la prueba en distintos laboratorios internacionales con muestras estándar de referencia y otras de campo. Tras esta validación la prueba suele publicarse en revistas científicas apropiadas para que pueda ser candidata a ser incluida en estándares internacionales tipo EPPO, IPPC-FAO o ISTA.

1. Técnica inmunológica que utiliza anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes. La reacción antígeno-anticuerpo se observa con un microscopio óptico dotado de epiiluminación ultravioleta. Debido a su buena sensibilidad analítica, es muy utilizada para detectar células bacterianas. Puede ser directa o indirecta, esta segunda es la más usada en Fitopatología y en ella se añade el anticuerpo específico y luego un anticuerpo antiespecie marcado generalmente con isotiocianato de fluoresceína. 2. (flow immunofluorescence). Técnica analítica inmunológica en la que se forma un complejo entre un colorante fluorescente y anticuerpos específicos contra la proteína a identificar. El complejo se reconoce en flujo mediante separadores de células automatizados en los que la fluorescencia se registra de forma sensible mediante un fotomultiplicador.

Sigla del inglés. Amplificación isotérmica mediada por bucle o asa, que utiliza una única temperatura para amplificar ácidos nucleicos y, por tanto, no requiere el uso de termocicladores ya que se puede realizar en baño termostático y la amplificación puede observarse visualmente mediante colorimetría, fluorescencia, etc. Está basada en el uso de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y cuatro cebadores específicos. El método se ha adaptado a la amplificación de ARN (RT-LAMP). Su utilización se está incrementando en el diagnóstico de muestras que requieren sencillez y rapidez, bajo coste económico y la posibilidad de su uso in situ en campo, mediante equipos portátiles. Sin embargo, en muchos casos no se suele conseguir el mismo nivel de sensibilidad analítica que con PCR o RT-PCR en tiempo real.

Enzima que cataliza la hidrólisis de un enlace glucosídico -(1,4) entre residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina de un mucopéptido presente en la pared celular de muchas bacterias. Esta acción debilita la estructura covalente de la pared y disminuye su resistencia al choque osmótico, que provoca la destrucción de las células. Se ha utilizado como tratamiento para incrementar la sensibilidad analítica en técnicas ELISA de detección al permitir aumentar el número de dianas de reacción.

En cualquier caso, se referirá específicamente a las especies de patógenos que se han controlado y a las técnicas y protocolos utilizados, que deberían ser de la máxima sensibilidad analítica.

Acrónimo del inglés. En español, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos. Método de amplificación isotérmica, que permite la amplificación exponencial de una determinada muestra de ADN o ARN, aunque está especialmente diseñada para la amplificación de ARN. Está basada en la actividad simultánea de tres enzimas para obtener una amplificación exponencial del ARN: transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), RNasa H y ARN polimerasa del bacteriófago T7. Las ventajas frente a los métodos basados en PCR o RT-PCR son su mayor rapidez, no requerir termociclador (ya que todo el proceso tiene lugar a 41 oC en un proceso isotérmico), alcanzar niveles de sensibilidad analítica similares a los de la PCR o RT-PCR en tiempo real y que los amplicones (ADNc) no suponen un riesgo de contaminación.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Proporción de plantas que sufren una infección o plaga, respecto a la población total de plantas sensibles. Indica la frecuencia de casos de enfermedad o de infección en una determinada población y en un momento dado. Los parámetros de diagnóstico como la sensibilidad y la especificidad no dependen de la prevalencia, ni la tienen en cuenta, mientras que los valores predictivos sí se ven influenciados por ella. Es clave estimar su magnitud esperada para seleccionar la técnica de detección o diagnóstico más apropiada. Ante una prevalencia esperada alta de un determinado patógeno, es más conveniente utilizar la técnica que proporcione los resultados más sensibles. Frente a una prevalencia esperada baja, se aconseja utilizar la técnica más específica, reduciendo así falsos resultados y aumentando la precisión analítica. En casos especiales de estaciones de cuarentena o programas de selección sanitaria, es conveniente utilizar varias técnicas para lograr combinar alta sensibilidad analítica y buena especificidad, pues se desconoce la prevalencia real, aunque se espere baja.

Aquella o aquellas que permiten de manera rápida y económica pero estandarizada, inferir la presencia o ausencia de planta infectada/infestada, enfermedad, vector, analito, metabolito o microorganismo de interés, en una población natural o cultivada de plantas o en un territorio o zona extensa, como detectar la presencia de vectores virulíferos o bacterilíferos en una zona o en un vivero. Todo resultado positivo con un análisis presuntivo debe ser confirmado con una prueba confirmatoria, que además localice el foco o las plantas infectadas. Es recomendable que las pruebas presuntivas sean de alta sensibilidad analítica, puesto que, aunque pueden arrojar un cierto porcentaje de falsos positivos, se pretende detectar el mayor número de individuos positivos, enfermos/infestados o con la condición de interés, entre la población de sospechosos (con alta probabilidad pretest de infección).

Técnica serológica o inmunológica de alta sensibilidad analítica que utiliza conjugados con productos radiactivos. Sistema muy versátil como ELISA y sus variantes, pero que en vez de con enzimas como en ELISA, se utiliza con marcadores radiactivos, frecuentemente I125. La lectura de resultados se efectúa mediante un lector provisto con contador de centelleo para cuantificar el contenido radiactivo de las muestras marcadas, normalmente emisoras débiles de radiación beta o gamma. Está en desuso ante los inconvenientes del manejo de radioactividad y las ventajas de ELISA para análisis de rutina.

Grado en que las especiales condiciones de prueba alteradas, como modificaciones en temperatura, volumen, intensidad de lavado, cambio de reactivos, etc., afectan a los valores de rendimiento de la prueba establecidos como su sensibilidad analítica y especificidad analítica. Constituye un criterio de validación.

Denominación común del método serológico de inmunodifusión simple, radial o de Mancini, pero en tubo. En este método, la muestra (solución de antígeno o extracto bruto o clarificado de una planta infectada) se coloca en un tubo de ensayo que contiene anticuerpos específicos mezclados con agar antes de que solidifique. Los antígenos de la muestra, caso de contener el patógeno homólogo a los anticuerpos utilizados, difundirán dentro del agar y formarán un precipitado o banda al llegar a la equivalencia. Técnica en desuso ante otras posibilidades de mayor sensibilidad analítica y que requieren menor consumo de anticuerpos.

La cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado. Intuitivamente, el límite de detección sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito) que el método analítico sería capaz de discriminar de la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente.

1. Menor cantidad o proporción de muestra que puede identificarse con fiabilidad. 2. Tendencia de una célula u organismo a mostrar síntomas o signos de enfermedad ante un determinado patógeno o estrés. 3. Grado o medida de la eficacia de un determinado instrumento, aparato o técnica, para detectar (cuantificar o medir cualitativamente) el efecto o resultado de una reacción.