Diccionario

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa o reversa. Técnica de laboratorio comúnmente utilizada para generar copias de ADN partiendo de dianas de ARN. Se usa una enzima llamada retrotranscriptasa que convierte un segmento específico de ARN en un fragmento complementario de ADN. Luego, otra enzima llamada ADN polimerasa amplifica (produce en grandes cantidades) ese segmento de ADN. En el caso de que se utilice la técnica para evaluar actividad de transcripción, las copias de ADN amplificadas ayudan a identificar si hay un gen que produce la molécula específica de ARNm. Es posible usar la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción para detectar ciertos cambios en un gen o cromosoma, o para identificar la activación de ciertos genes, lo que ayuda a diagnosticar enfermedades, y para el estudio del ARN de ciertos virus (la gran mayoría de virus fitopatógenos poseen genoma de ARN). Posee las mismas variantes de reacción que la PCR.

Técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que no precisa de ciclos de temperaturas para la desnaturalización de las hebras de ADN, ya que, debido a la acción de enzimas de restricción que generan mellas en el ADN, este proceso se realiza de forma enzimática. Es una modificación de la PCR o RT-PCR simple convencional que mejora su rendimiento final. Se basa en la capacidad de una ADN polimerasa modificada, para desplazar una hebra monocatenaria resultante de un corte en una región específica y a partir de esta hebra desplazada, iniciar la replicación o amplificación de ese ADN diana. Con este procedimiento, las hebras desplazadas sirven como molde para los nuevos ciclos de amplificación, generando por un lado que los productos de amplificación se multipliquen por más del doble al final de cada ciclo de amplificación y por otro, que se observe un incremento en la velocidad de reacción, sensibilidad y especificidad de la técnica respecto a la PCR o RT-PCR simple convencional. Se puede llevar a cabo la replicación, amplificación o la secuenciación de un ADN mediante una ADN polimerasa del tipo fago φ29 o 29 (Phi29). Se realiza en un único tubo, lo que contribuye a evitar contaminaciones, en plataformas convencionales de la PCR cuantitativa, con un mayor número y concentración de cebadores. Incrementa la eficiencia y sensibilidad de la PCR, y se efectúa aumentando la velocidad final de la reacción.

Estimación cuantitativa de la infección por virus que se calcula por la cantidad de partículas virales en un tejido concreto de la planta, semilla, vector o extracto vegetal, como, por ejemplo, ARN viral por volumen de extracto o por peso de tejido o por vector individual. Se suele calcular por el número de copias obtenidas por amplificación molecular cuantitativa tras PCR o RT-PCR en tiempo real. También se aplica el término a bacterias y hongos. En ocasiones se utiliza como sinónimo de título viral o microbiano.

Técnica de inmovilizado de dianas de agentes patógenos en un soporte sólido (membrana de papel, nitrocelulosa, éster de celulosa, nailon, etc.) para su posterior detección mediante pruebas inmunológicas, de hibridación o especialmente de amplificación molecular (PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real o isotermas). Se presiona hasta aplastar directamente el material vegetal en el soporte sólido durante unos segundos o al posible vector, con ayuda en este caso, del fondo redondeado de un tubo de plástico o vial. Se puede realizar en campo o laboratorio por personal no especializado en métodos de detección o diagnóstico. Las dianas impresas pueden ser conservadas en un lugar oscuro y seco durante meses antes de su análisis o ser remitidas por correo a temperatura ambiente hasta un laboratorio para su procesado. Su uso no implica problemas cuarentenarios y suele ser empleado en pruebas interlaboratorio y como control positivo o negativo (material vegetal certificado sano), en algunos kits de diagnóstico y detección.

Vocablo inglés, también utilizado comúnmente en español. Se refiere al conjunto de procedimientos o pruebas biológicas con una serie o gama de plantas indicadoras, normalmente leñosas inoculadas por injerto, para detectar la presencia de agentes patógenos transmisibles por injerto del material vegetal analizado (algunas bacterias, entre ellas todos los fitoplasmas, micoplasmas entre ellos los espiroplasmas, algunos hongos y oomicetos, virus y viroides). El término también incluye a las pruebas biológicas con una serie de plantas indicadoras herbáceas inoculadas mecánicamente. El procedimiento general consiste en tomar material de una planta problema a analizar y transferirlo por injerto o inoculación mecánica a otra planta (denominada indicadora) que desarrollará, tras un período de tiempo variable, síntomas más o menos característicos del patógeno buscado, caso de estar presente. Normalmente, las plantas inoculadas son mantenidas en las condiciones más apropiadas para la expresión de la infección. La manifestación de síntomas sucede en días en el caso de plantas indicadoras herbáceas, pero en los indicadores leñosos transcurren generalmente meses. El método es muy sensible pues permite la multiplicación del patógeno inoculado por injerto en la planta indicadora hasta provocar síntomas. Se ha realizado extensivamente durante décadas para selección sanitaria en la práctica totalidad de cultivos leñosos y algunos herbáceos como la fresa, antes de la aplicación de otras tecnologías como las serológicas ELISA, la hibridación o la amplificación molecular por PCR en tiempo real o la secuenciación masiva. Posibilita la detección de agentes patógenos transmisibles por injerto, aún de los de etiología desconocida, razón por la que se continúa utilizando en algunos casos específicos y países. Actualmente es habitual simultanear pruebas sensibles y específicas de laboratorio (por ejemplo, se usa la inmunoimpresión-ELISA con anticuerpos monoclonales o RT-PCR en tiempo real, para detección fiable del virus de la tristeza de los cítricos, Closterovirus tristezae o Citrus tristeza virus-CTV, sustituyendo a la clásica planta indicadora de lima mexicana). Así, se logra reducir el uso de plantas indicadoras que resulta lento, caro, no suficientemente específico y precisa personal especializado para la lectura de síntomas y espacio de invernadero o cámara climática para la realización de las pruebas. No obstante, constituye una prueba definitiva, y frecuentemente única, para demostrar la patogenicidad y valorar la agresividad de un agente patógeno en distintos huéspedes o anfitriones. 2. En ocasiones, se utiliza el término para referirse de modo amplio a una serie de pruebas, no solamente de inoculación en plantas indicadoras, para conocer el estado sanitario de una planta o sus productos (bulbos, semillas, tubérculos, etc.) a modo de cribado.

Contaminante orgánico e inorgánico incluido en la muestra de ADN o ARN que interfiere atenuando o inhibiendo completamente la reacción de amplificación por PCR o RT-PCR. La mayoría frecuentemente provienen de la muestra vegetal, del suelo o de la muestra de artrópodos analizada. Pero también pueden proceder del propio operador o del material y tampones utilizados para la amplificación, que han sido contaminados por el operador. Existe una amplia gama de métodos y protocolos y normas o precauciones de trabajo para reducirlos y de kits comerciales que eliminan o reducen significativamente los distintos inhibidores procedentes de la muestra.

1. Uso de anticuerpos específicos para sensibilizar o tapizar tubos en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR o RT-PCR) con el fin de enriquecer en los patógenos de interés aquellos presentes en el extracto bruto de la muestra, en una fase previa a su detección. Requiere la obtención de extractos, pero evita la purificación de ácidos nucleicos de la muestra. Consiste en varias etapas: i) concentración de viriones o de células de cualquier otro patógeno presentes en el extracto vegetal por captura en las paredes de los tubos de PCR tapizados con anticuerpos específicos; ii) eliminación por sucesivos lavados de los restos del extracto vegetal e inhibidores no inmunocapturados; iii) realización de la reacción de amplificación en el mismo tubo. Los ácidos nucleicos del patógeno a detectar son liberados por el calor de la reacción. El método mejora la sensibilidad de la PCR o RT-PCR simple convencional, además de reducir inhibidores de los extractos vegetales y constituye un método sencillo y económico de preparación de muestras para amplificación, aunque su sensibilidad y sencillez ha sido muy superada por otras versiones de PCR. 2. (trapping). Tapizado o sensibilización con anticuerpos específicos de rejillas de microscopía electrónica con el fin de atrapar selectivamente partículas virales, células bacterianas o fúngicas presentes en la muestra depositada en la rejilla.

Sigla del inglés. Amplificación isotérmica mediada por bucle o asa, que utiliza una única temperatura para amplificar ácidos nucleicos y, por tanto, no requiere el uso de termocicladores ya que se puede realizar en baño termostático y la amplificación puede observarse visualmente mediante colorimetría, fluorescencia, etc. Está basada en el uso de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y cuatro cebadores específicos. El método se ha adaptado a la amplificación de ARN (RT-LAMP). Su utilización se está incrementando en el diagnóstico de muestras que requieren sencillez y rapidez, bajo coste económico y la posibilidad de su uso in situ en campo, mediante equipos portátiles. Sin embargo, en muchos casos no se suele conseguir el mismo nivel de sensibilidad analítica que con PCR o RT-PCR en tiempo real.

Acrónimo del inglés. En español, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos. Método de amplificación isotérmica, que permite la amplificación exponencial de una determinada muestra de ADN o ARN, aunque está especialmente diseñada para la amplificación de ARN. Está basada en la actividad simultánea de tres enzimas para obtener una amplificación exponencial del ARN: transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), RNasa H y ARN polimerasa del bacteriófago T7. Las ventajas frente a los métodos basados en PCR o RT-PCR son su mayor rapidez, no requerir termociclador (ya que todo el proceso tiene lugar a 41 oC en un proceso isotérmico), alcanzar niveles de sensibilidad analítica similares a los de la PCR o RT-PCR en tiempo real y que los amplicones (ADNc) no suponen un riesgo de contaminación.

Técnica de PCR que permite la amplificación de ADN o ARN cuando solo se conoce el extremo 3′ de la secuencia de interés. Por ejemplo, el extremo 5′ de la región a amplificar es artificialmente creado añadiendo una cola de nucleótidos definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un cebador 5′. A partir de aquí se realiza una PCR simple convencional. También puede efectuarse la versión RT-PCR anclada.

Variante de la PCR convencional simple que comprende dos rondas de amplificación consecutivas, con distintos pares de cebadores (externos e internos a la secuencia diana), con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el fragmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica. Se efectúa consecutivamente en dos tubos distintos, implicando dicha operación serios riesgos de contaminación, pues supone abrir el tubo con los amplicones de la primera ronda para realizar la segunda ronda de amplificación. Para solventar el problema se han diseñado protocolos en un solo tubo cerrado. La PCR anidada supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de la PCR o RT-PCR convencional.

Procedimiento para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR o RT-PCR anidada o la semianidada en dos rondas consecutivas de amplificación en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación por aerosoles al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. Para solventar este problema, se desarrolló un sistema para la separación física de los cebadores externos e internos dentro de un mismo tubo, mediante el uso de la parte final de una punta de pipeta de 100 L en cuyo interior se deposita el segundo cóctel y donde se mantiene por capilaridad. Esta estrategia permite realizar las dos amplificaciones sin abrir o cambiar de tubo. Transcurrida la primera amplificación, es suficiente agitar levemente el tubo para que el segundo cóctel se mezcle con el resultado de la primera amplificación y, sin abrir el tubo, comience la segunda amplificación. La PCR anidada en un solo tubo cerrado supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de PCR o RT-PCR convencional y es interesante cuando no se dispone de otras opciones como PCR en tiempo real. También puede efectuarse la versión RT-PCR en un solo tubo cerrado.

Variante de la PCR simple convencional que consiste en la amplificación preferencial de una de las cadenas del ADN diana. También puede efectuarse la versión RT-PCR asimétrica.

Método de PCR basado en la acción simultánea y coordinada de cuatro cebadores, que permite la detección de bacterias y virus de ARN, viroides y otros ARN transcritos, en su variante de RT-PCR. La reacción tiene lugar en un único cóctel y en un solo tubo cerrado. En el caso de RT-PCR, la transcripción reversa y simultánea de los fragmentos, la coordinación entre cebadores externos e internos y la cooperación de los amplicones a modo de cebadores o iniciadores son la base del método. Su sensibilidad es similar a la del PCR y RT-PCR anidada, que resulta ser 100 veces mayor que la obtenida con PCR o RT-PCR simples y utiliza 10 veces menos reactivos. Es una opción económica si no se dispone de termociclador para PCR en tiempo real. También puede realizarse la versión RT-PCR cooperativa.

Método que supone una modificación de la PCR simple convencional ya que permite cuantificar la cantidad inicial de un fragmento diana presente en la muestra original, ya sea ADN o ARN (ADNc). Las dos metodologías de PCR cuantitativa más frecuentemente utilizadas son actualmente: PCR en tiempo real y PCR digital. También es muy frecuente la versión RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR).

Reacción de PCR que se basa en el inicio de la reacción a temperaturas elevadas con el fin de evitar la amplificación de productos inespecíficos. Se logra mediante el uso de una enzima ADN polimerasa que solo se active a altas temperaturas. Puede efectuarse en su versión RT-PCR de arranque caliente.

Reacción de amplificación que permite generar un producto, de miles de pares de bases, mucho más extenso que mediante una PCR simple convencional. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de largo alcance.

Método de PCR para evitar que los cebadores amplifiquen secuencias no específicas. El procedimiento se basa en que la especificidad de los productos de la reacción depende de la temperatura de hibridación a la que se produce la misma. Cuanto menor es la temperatura, menor es la especificidad. Además, se basa en que la temperatura de fusión del ADN (Tm) de los iniciadores establece un límite superior a la temperatura de hibridación. Al mantener inicialmente la temperatura muy cerca de la temperatura de fusión de los cebadores, los productos más específicos se amplificarán primero y, por lo tanto, no serán absorbidos por los productos no específicos a medida que se reduce la temperatura de la reacción. Además, la amplificación inicial hace que haya más dianas de la secuencia específica disponible para la amplificación, lo que también ayuda a superar a los productos no específicos. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de toma de contacto.

Variante que se diferencia de una PCR simple o convencional estándar en que utiliza un conjunto de cebadores con secuencias degeneradas en vez de un solo par de cebadores de secuencia única. Permite amplificar genes nuevos y familias multigénicas. Constituye una herramienta clave en estudios evolutivos a nivel molecular. Se basa en el diseño de un cebador degenerado con el fin de detectar o encontrar un gen a partir de secuencias de ADN disponibles de otros organismos estrechamente relacionados. También es muy frecuente la versión RT-PCR degenerada.

Tecnología similar a la PCR en tiempo real, pero que se basa en la separación de la muestra inicial en gran cantidad de alícuotas que son amplificadas individualmente y permite la cuantificación precisa y absoluta del producto amplificado. Se obtiene mayor sensibilidad que con PCR en tiempo real, hay menor efecto negativo de inhibidores y requiere baja cantidad de reactivos, pero los equipos y reactivos tienen en la actualidad un coste más elevado. También es frecuente la versión RT-PCR digital.

Tecnología de última generación derivada de la PCR digital, que está siendo utilizada en distintos campos científicos para la cuantificación de ADN, mostrándose como una técnica más sensible que la PCR en tiempo real. Permite una cuantificación absoluta del ADN de organismos en muestras ambientales. Es una forma digital del método de PCR que utiliza un sistema de emulsión de agua y aceite. Esta técnica divide las muestras de ácido nucleico en miles de gotas de un volumen de pocos nanolitros. Luego, la amplificación por PCR se realiza dentro de cada gota y, por lo tanto, requiere menos muestra que otros tipos de PCR. Se ha aplicado a hongos asociados a la enfermedad del pie negro y a la detección de Ilyonectria liriodendri (sin. Cylindrocarpon liriodendri) y de numerosos organismos de cuarentena. También puede aplicarse en su versión RT-PCR digital de gotas.

Variante de la técnica de PCR simple convencional donde se emplean dos pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente dos segmentos distintos de ADN. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de dos aislados o cepas del mismo patógeno o de dos patógenos diferentes, incluso si son de ADN y ARN. También es frecuente la PCR múltiple y la versión RT-PCR dúplex.

Método que permite monitorear la reacción de PCR o RT-PCR durante el proceso de amplificación, posibilitando la detección y cuantificación del organismo diana en la muestra en un único proceso realizado en placas o tubos. En teoría, hay una relación cuantitativa entre la cantidad de la secuencia diana inicial y la cantidad del producto amplificado en cualquier ciclo de la amplificación. Mediante la inclusión de fluorocromos se puede monitorizar el progreso de la reacción de amplificación en tiempo real, midiendo la fluorescencia liberada cada vez que se realiza una copia del ADN molde, puesto que el incremento de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN generado. Al permitir el seguimiento de la reacción en tiempo real, se elimina la necesidad de manipular los amplificados en pasos de post-PCR, disminuyendo riesgos de contaminación entre muestras por aerosoles. La posibilidad de poder cuantificar las dianas la convierte, además, en una herramienta útil para determinar los niveles de inóculo en la muestra. Las técnicas de amplificación molecular en tiempo real se han convertido en las de referencia para diagnóstico y detección. Para el diseño de protocolos de detección mediante PCR en tiempo real se recomienda que los productos amplificados o amplicones sean de pequeño tamaño (80-150 pb), para poder alcanzar resultados óptimos en sensibilidad, especificidad y eficiencia. La posibilidad de utilizar sondas marcadas con distintas moléculas fluorescentes permite utilizar las técnicas de PCR o RT-PCR en tiempo real en formato múltiple. Sus aplicaciones son diversas además de la detección de patógenos y determinación de la carga viral, se usan en estudios de expresión génica (cuantificación absoluta con curva patrón y cuantificación relativa con gen control endógeno), detección de SNP, o estudios de discriminación alélica, entre otras. La técnica permite procesar muestras compuestas preparadas por métodos directos, en menos de 2 h. También es muy utilizada en la versión RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR).

PCR que se basa en una reacción de amplificación en células o en secciones de tejidos. Los productos de PCR generados pueden visualizarse localizados en el lugar donde se produjo la amplificación. También es utilizada en la versión RT-PCR in situ.

Variante de la técnica de PCR simple convencional en la que se emplean dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Permite detectar ADN de dos o más patógenos en la misma muestra. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de distintos aislados o cepas del mismo patógeno o combinaciones de estos con otros patógenos diferentes, incluso de ADN y ARN simultáneamente, siendo muy frecuente la versión RT-PCR múltiple.

La PCR o RT-PCR semianidada utiliza dos cebadores externos y un único cebador interno. Este procedimiento permite aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR simple convencional. Generalmente, las amplificaciones se realizan en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. La versión RT-PCR semianidada es muy utilizada.

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

Denominación común de aquellas pruebas que suponen una amplificación molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa de ácidos nucleicos o isotérmica. Como PCR o RT-PCR simple y sus variantes, PCR en tiempo real y sus variantes, LAMP, NASBA y sus variantes.

Proceso que implica la generación de una cadena de ácido desoxirribonucleico doble cadena complementario (ADNc) a partir de ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple. La primera hebra de ADNc obtenida es la cadena complementaria de la cadena molde de ARN, y a partir de ella se sintetiza la segunda hebra de ADN para obtener una molécula bicatenaria. Como los viroides y la gran mayoría de los virus de plantas poseen genoma de ARN, la transcripción reversa se ha convertido en la técnica de referencia para la detección de ARN de patógenos mediante RT-PCR. El ARN es convertido o retrotranscrito a ADNc mediante el uso de cebadores de PCR y la acción de la enzima transcriptasa reversa.

Sigla de unidad formadora de placa o calva. Se utiliza para cuantificar el número de partículas de bacteriófagos capaces de formar calvas (placas) por unidad de volumen. Se trata de una estima de la cantidad absoluta de partículas virales, pues no contabiliza las partículas virales defectivas o las que no logran infección. Es equivalente al concepto de ufc, pero mediante citometría de flujo o RT-PCR en tiempo real cuantitativa, se pueden cuantificar de manera precisa las partículas de genoma vírico totales (funcionales y no funcionales).

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).