Diccionario

Estudio de los fragmentos de ADN de tamaño previsible originados por la digestión (corte) de una cadena de ADN por una enzima de restricción específica. Las alteraciones (mutaciones o polimorfismos) producidas en la secuencia de ADN que destruyen o crean nuevos sitios de corte en el ADN, modifican el tamaño y el número de los fragmentos de ADN resultantes de dicha digestión.

Enzima de restricción proveniente de la bacteria modelo Escherichia coli que reconoce la secuencia G’AATTC (el apóstrofe señala el sitio de corte). Muy utilizada en manipulación genética ya que el vector de clonación pBR322 presenta un único sitio de rotura, que es precisamente reconocido por esta enzima, que fue una de las primeras en ser clonadas y producidas industrialmente.

Aquella que contiene fragmentos del ADN genómico generados mediante fragmentación aleatoria del genoma (sonicación) o la digestión parcial con cantidades limitantes de una enzima de restricción, la cual efectúa cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada en el genoma. Como consecuencia, se produce una digestión parcial y aleatoria del ADN, de modo que solo tiene lugar la fragmentación de unos cuantos sitios de restricción, quedando el resto intacto. Así se genera una colección de fragmentos superpuestos con una longitud idónea para la clonación en un vector de clonación apropiado. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN, se introduce en una célula huésped o anfitriona.

Enzima que cataliza la modificación química de ciertas bases del ADN por metilación de los nucleótidos de un sitio de reconocimiento de restricción, correspondiente a sus propias enzimas de restricción. Esta enzima protege al propio ADN frente al ataque por sus propias enzimas de restricción. La metilasa de modificación M.EcoRI se ha utilizado frecuentemente para metilar ADN foráneo y protegerlo frente a la enzima de restricción EcoRI.

Variante de PCR que permite realizar una amplificación de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN del que solo se conoce parte de su secuencia interna. El ADN genómico que contiene la secuencia nucleotídica flanqueada (en inglés, core region) se digiere por completo con una enzima de restricción que lo escinde en una serie de fragmentos dejando intacta dicha secuencia y las lindantes. Originalmente estos fragmentos no podían exceder de dos o tres kilobases de extensión. Los fragmentos lineales se circularizan (transforman en círculos) con una ADN-ligasa en condiciones que favorecen la formación de círculos monoméricos (compuestos de un solo fragmento y no de varios fragmentos concatenados) y se amplifican con dos iniciadores que son complementarios de sendos extremos de la secuencia conocida, pero cuyos extremos 3’ apuntan hacia fuera de la región comprendida por ambos, a la inversa de lo que sucede en la PCR simple normal, de modo que lo que se amplifica son las secuencias flanqueantes (y no la flanqueada). El producto de esta reacción en cadena será, pues, una molécula lineal de ADN bicatenario constituida por ambas secuencias flanqueantes dispuestas una a continuación de la otra, según el Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas, de página electrónica: www.medtrad.org/panacea.html.

Mecanismo de protección de la célula bacteriana ante un ADN extraño. Se sirve de endonucleasas específicas denominadas de restricción que cortan las dos cadenas del ADN por sitios muy específicos. La célula que sintetiza la enzima de restricción normalmente está protegida contra su actuación, ya que también sintetiza una enzima de modificación que altera la estructura del ADN de los sitios habitualmente reconocidos por la endonucleasa. Si una célula con el sistema de modificación activo se infecta con un bacteriófago cuyo ADN no ha sido previamente modificado, su ADN será cortado en varios fragmentos en función del número de lugares susceptibles y finalmente será degradado por exonucleasas. En esta situación, la probabilidad de que el fago inicie una infección es varios órdenes de magnitud menor que si el ADN de fago hubiera sido modificado.

Secuencia de DNA a la que se une específicamente una enzima de restricción. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen y cortan el ADN en secuencias de tetra-, penta-, hexa- o heptanucleótidos que generalmente poseen un eje de rotación de simetría.

Denominación común de la transferencia tipo Southern, hibridación realizada sobre fragmentos de ADN transferidos a una membrana; el método recibió este nombre en honor a su inventor, Edwin Southern. El ADN intacto (por ejemplo, un perfil de plásmidos) o digerido con una enzima de restricción es separado electroforéticamente por tamaño en un gel, tras lo que se procede a una depurinación (para facilitar la transferencia de fragmentos largos) y desnaturalización de los fragmentos de ADN de doble cadena en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro, frecuentemente de nitrocelulosa, éster de celulosa o nailon, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. El filtro se incuba durante un tiempo con una sonda de ADNss o ARN marcada (radiactivamente, con digoxigenina o con un fluorocromo, entre otros); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas, mediante revelado con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina para sondas marcadas con digoxigenina o con una película sensible a la luz para el caso de sondas marcadas con un fluorocromo. Las hibridaciones con sondas marcadas con digoxigenina pueden revelarse también utilizando un sustrato quimioluminiscente, que es degradado por la fosfatasa alcalina y que emite luz; esta luz puede ser captada por una película o digitalmente por una cámara apropiada.

Aquel de clonación que debe reunir unas características básicas y adecuadas para su uso en experimentos de transformación. Deben ser portadores de algún marcador genético seleccionable en la estirpe receptora, y tener secuencias únicas de reconocimiento para alguna enzima de restricción que permita su forma lineal para poder insertarle el ADN exógeno. Generalmente son plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura.

Enzima capaz de degradar de forma inespecífica moléculas de ADN extrañas con la finalidad de proteger a las células de la invasión por ADN foráneo o ajeno. Reconocen un sitio específico del ADN y cortan la doble hebra en algún punto cercano (tipo I), actúan sobre secuencias cortas y palindrómicas rompiendo en el mismo lugar de reconocimiento (tipo II), o reconocen secuencias asimétricas cortas que rompen a 24-26 pb del lugar de reconocimiento (tipo III).