Diccionario

Componente de una molécula que hace que esta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molécula que absorbe energía de una longitud de onda específica y la vuelve a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, es decir, con menor energía. La cantidad de energía emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio fluorocromo como de su ambiente químico. Se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los elementos que componen la célula, lo que permite identificar distintas moléculas o conjuntos de moléculas. Puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas, como anticuerpos que específicamente reconocen a antígenos. Así pueden ser utilizados en inmunofluorescencia (para visualizar células bacterianas o fúngicas), en inmunohistoquímica (utilizada en Bacteriología y Virología) o en el análisis o detección de ADN mediante la técnica de PCR en tiempo real. El isotiocianato de fluoresceína, reactivo derivado de la fluoresceína es uno de los fluorocromos más habituales, otros comunes son los derivados de la rodamina, cumarina y cianina. Las nuevas generaciones como el Alexa Flúor o los DyLight Flúor y otros, son generalmente más fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros colorantes estándar de excitación.

Citometría de flujo en la que se utilizan diferentes fluorocromos para marcar las células o partículas en suspensión que se analizan. Los distintos fluorocromos absorben energía luminosa de una longitud de onda específica y la reemiten a una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda a las que el fluorocromo absorbe y emite luz se conocen como espectros de excitación y emisión del fluorocromo, respectivamente; ello le confiere diferente color o espectro de fluorescencia para su identificación específica.

Anticuerpo, antígeno, sustancia inerte, metal, proteína o agente patógeno marcado con enzimas (normalmente fosfatasa alcalina o peroxidasa), biotina, avidina o estreptavidina, isotiocianato de fluoresceína u otros fluorocromos, proteína verde fluorescente, oro coloidal, hierro o cualquier elemento, compuesto o sustancia que le confiera nuevas propiedades delatoras. El objetivo del marcado es facilitar la detección o cuantificación de un organismo o compuesto tras producirse la reacción antígeno-anticuerpo, su multiplicación en una colonia o la infección en una planta convencional o transgénica.

Sistema de iluminación superior con luz ultravioleta en un microscopio de fluorescencia. En el mismo, la luz que incide sobre la muestra estudiada no la atraviesa, sino que la misma lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra. Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas moléculas denominadas fluorocromos.

Nombre genérico que se aplica a cualquier variante de la técnica de hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas individualmente con un fluorocromo específico o una combinación de fluorocromos distintos, que proporciona una imagen polícroma de los cromosomas, del cariotipo, o de la hibridación específica realizada.

Variante de FISH multicolor en la que la visualización policroma simultánea de los cromosomas metafásicos o de la hibridación específica realizada, se logra mediante marcado combinatorio de las sondas con varios fluorocromos y con ayuda de un microscopio de fluorescencia, equipado con una serie de filtros ópticos específicos de los fluorocromos utilizados. Un programa informático complejo combina las imágenes obtenidas sucesivamente con cada filtro en una única imagen de los cromosomas en colores artificiales distintos.

Técnica basada en la utilización de sondas de ADN para detectar (y, a veces, cuantificar) genes o secuencias nucleotídicas específicas y localizar dichos genes o secuencias en cromosomas metafásicos o núcleos en interfase. En este caso, la sonda (ADN o ARN) se marca por conjugación química directa con un fluorocromo, usualmente de la clase de las cumarinas, fluoresceínas, rodaminas o cianinas, o bien por conjugación química con una molécula no fluorescible, como la biotina o un hapteno (por ejemplo la digoxigenina o el dinitrofenol), capaz a su vez de unirse posteriormente a una segunda molécula marcada con un fluorocromo, como la avidina, en el caso de la biotina, o a un anticuerpo específico, en el caso del hapteno. Tras la hibridación y los lavados respectivos, la sonda se irradia, el fluorocromo emite luz de una determinada longitud de onda (y por consiguiente de un determinado color) y ello permite distinguir la secuencia complementaria como una mancha de color vivo al microscopio de fluorescencia, según definición del Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas (www.medtrad.org/panacea.html).

Interpretación del cromatograma de secuenciación del ADN de interés con ayuda de un programa informático adecuado y su traducción en la secuencia nucleotídica respectiva. Durante la secuenciación automática de ADN basada en el método de Sanger, en la base del gel de electroforesis, un rayo láser excita los fluorocromos presentes en los fragmentos monocatenarios de ADN a medida que estos últimos van pasando frente a él y unos detectores captan la intensidad de la fluorescencia emitida en cuatro longitudes de onda distintas. El láser y los detectores recorren permanentemente la base del gel durante la electroforesis a fin de construir una imagen del mismo. Seguidamente se efectúa un análisis informático para convertir dicha imagen en una secuencia de nucleótidos, según el Vocabulario inglés-español de bioquímica y biología molecular de María V. Saladrigas (www.medtrad.org/panacea.html).

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Método que permite monitorear la reacción de PCR o RT-PCR durante el proceso de amplificación, posibilitando la detección y cuantificación del organismo diana en la muestra en un único proceso realizado en placas o tubos. En teoría, hay una relación cuantitativa entre la cantidad de la secuencia diana inicial y la cantidad del producto amplificado en cualquier ciclo de la amplificación. Mediante la inclusión de fluorocromos se puede monitorizar el progreso de la reacción de amplificación en tiempo real, midiendo la fluorescencia liberada cada vez que se realiza una copia del ADN molde, puesto que el incremento de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN generado. Al permitir el seguimiento de la reacción en tiempo real, se elimina la necesidad de manipular los amplificados en pasos de post-PCR, disminuyendo riesgos de contaminación entre muestras por aerosoles. La posibilidad de poder cuantificar las dianas la convierte, además, en una herramienta útil para determinar los niveles de inóculo en la muestra. Las técnicas de amplificación molecular en tiempo real se han convertido en las de referencia para diagnóstico y detección. Para el diseño de protocolos de detección mediante PCR en tiempo real se recomienda que los productos amplificados o amplicones sean de pequeño tamaño (80-150 pb), para poder alcanzar resultados óptimos en sensibilidad, especificidad y eficiencia. La posibilidad de utilizar sondas marcadas con distintas moléculas fluorescentes permite utilizar las técnicas de PCR o RT-PCR en tiempo real en formato múltiple. Sus aplicaciones son diversas además de la detección de patógenos y determinación de la carga viral, se usan en estudios de expresión génica (cuantificación absoluta con curva patrón y cuantificación relativa con gen control endógeno), detección de SNP, o estudios de discriminación alélica, entre otras. La técnica permite procesar muestras compuestas preparadas por métodos directos, en menos de 2 h. También es muy utilizada en la versión RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR).

Proteína aislada originalmente a partir de la medusa Aequorea victoria. La proteína verde fluorescente nativa tiene un tamaño de 27 kDa (238 residuos de aminoácido), absorbe luz azul con un máximo a 395 nm y emite luz verde con un máximo a 510 nm, tanto en organismos bioluminiscentes como en estado puro en solución. A diferencia de otros marcadores fluorescentes no requiere sustratos exógenos para emitir fluorescencia. Por sus propiedades fluorescentes y su relativa estabilidad, se ha convertido en el marcador más utilizado para la detección de la expresión génica y especialmente para la localización subcelular de proteínas. Es in vitro una proteína muy estable y resistente a altas temperaturas (tm=70 °C), a pH alcalino, a detergentes, a disolventes orgánicos y a las proteasas más comunes, con excepción de la pronasa. Soporta tratamientos con glutaraldehido lo que permite su observación en muestras fijadas para estudios de microscopía. Su fluorescencia se pierde si la proteína es desnaturalizada tras tratamientos a temperatura muy elevada, a pH extremos o tratamientos con cloruro de guanidina, y puede ser recuperada parcialmente si la proteína se renaturaliza. Se trata de un marcador ideal tanto para visualizar microorganismos como para determinar expresión génica, localizar proteínas a nivel subcelular o aplicarla a estudios de supervivencia bacteriana o fúngica; sus ventajas como marcador en bacterias se resumen en: i) es fácil de detectar; ii) no precisa sustrato exógeno; iii) permite visualizar células individuales; iv) permite un sencillo procesado de las muestras incluso en muestras fijadas si es necesario; v) ofrece la posibilidad de observar bacterias en su entorno natural, sin destruirlo y en tiempo real; vi) permite analizar células vivas y discriminarlas; vii) se puede utilizar en combinación con otros fluorocromos; y viii) no suele plantear problemas de ruido de fondo por autofluorescencia de las bacterias. Ha facilitado enormemente el estudio de las interacciones planta-patógeno y se utiliza en multitud de especies fitopatógenas como un marcador para caracterizar el proceso completo de colonización, para estudiar el patrón espacial de expresión génica y de localización proteica en distintos agentes patógenos. Ha permitido un extraordinario progreso en el conocimiento de los aspectos celulares y moleculares de las interacciones patógeno-huésped o anfitrión. Además, los organismos transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente pueden detectarse fácilmente en el interior de la planta sin ninguna intervención externa, proporcionando una valiosa información del desarrollo del patógeno dentro de la planta. Los cambios de secuencia realizados en el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) han dado lugar a numerosas variantes de excitación y de emisión, disponibles comercialmente.

Sistema muy utilizado en biología como marcador en numerosos métodos de detección de proteínas y ácidos nucleicos. La unión no covalente biotina-avidina es muy estable. La constante de afinidad del complejo biotina-avidina es de 1015 M-1, una de las más altas conocidas (como referencia, la afinidad entre antígeno y anticuerpo suele ser de alrededor de 1012 M-1). La estreptavidina es la proteína marcadora de uso más habitual ya que es no glicosilada y muestra niveles bajos de unión inespecífica y ha sustituido a la avidina que es una glicoproteína altamente catiónica y puede producir coloración de fondo inespecífica en algunas aplicaciones, debido a sus residuos cargados positivamente y componentes de oligosacáridos. El sistema es muy utilizado y hace posible que el uso de moléculas (frecuentemente anticuerpos) o compuestos biotinilados sean revelados con estreptavidina marcada o conjugada con enzimas, oro coloidal, hierro, fluorocromos, etc. o cualquier sustancia o elemento delator. El sistema es utilizado en técnicas ELISA, citometría de flujo, inmunotransferencia, inmunohistoquímica, inmunoelectromicroscopía de decoración, adquisición de imágenes fluorescentes, sondas de ADN para hibridación Southern o in situ, o detección en general. También se usan resinas y gránulos magnéticos de estreptavidina conjugada para aislar proteínas, células y ADN, o en separación biológica.

Método para estimar la concentración de fragmentos de ADN o de moléculas de ARN o de proteína presentes en una muestra. Consiste en transferir directamente una alícuota de la muestra sobre una membrana de filtro de nitrocelulosa, éster de celulosa o nailon y en hibridar el ácido nucleico fijado a la membrana con una sonda. Si se trata de proteínas, consiste en hacer reaccionar la proteína de interés fijada a la membrana con un anticuerpo específico, previo marcado o conjugación de la sonda o del anticuerpo con isótopos radioactivos o fluorocromos. Tras lavados, la radiación ionizante o la fluorescencia emitida por la sonda o el anticuerpo se detectan por autorradiografía, fluorografía o imagen digital. Si en la membrana se ha incluido como referencia una serie de diluciones del mismo polinucleótido purificado o de la misma proteína purificada de concentración conocida, es posible cuantificar la cantidad de ácido nucleico o de proteína presente en la muestra analizada, por comparación de la intensidad de la mancha con la de la muestra de referencia. El método permite detectar hasta un picogramo (1 pg) de ácido nucleico; según definición del Vocabulario inglés-español de bioquímica y biología molecular de María V. Saladrigas (www.medtrad.org/panacea.html). Se denomina transferencia puntual cuando se efectúa de forma puntual o por hoyos.

Denominación común de la transferencia tipo Southern, hibridación realizada sobre fragmentos de ADN transferidos a una membrana; el método recibió este nombre en honor a su inventor, Edwin Southern. El ADN intacto (por ejemplo, un perfil de plásmidos) o digerido con una enzima de restricción es separado electroforéticamente por tamaño en un gel, tras lo que se procede a una depurinación (para facilitar la transferencia de fragmentos largos) y desnaturalización de los fragmentos de ADN de doble cadena en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro, frecuentemente de nitrocelulosa, éster de celulosa o nailon, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. El filtro se incuba durante un tiempo con una sonda de ADNss o ARN marcada (radiactivamente, con digoxigenina o con un fluorocromo, entre otros); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas, mediante revelado con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina para sondas marcadas con digoxigenina o con una película sensible a la luz para el caso de sondas marcadas con un fluorocromo. Las hibridaciones con sondas marcadas con digoxigenina pueden revelarse también utilizando un sustrato quimioluminiscente, que es degradado por la fosfatasa alcalina y que emite luz; esta luz puede ser captada por una película o digitalmente por una cámara apropiada.

Compuesto conjugado o marcado que se introduce en un cultivo in vitro, o que se utiliza como sustrato para una reacción realizada in vitro, con el objetivo de seguir o monitorizar el crecimiento o el metabolismo de un compuesto determinado. Se utilizan frecuentemente trazadores radiactivos, fluorocromos o proteínas fluorescentes y otros.