Diccionario

Proceso de enriquecimiento semiselectivo o selectivo en la misma microplaca ELISA tapizada con anticuerpos policlonales en la que directamente se realizará la detección serológica con anticuerpos monoclonales específicos, normalmente mediante ELISA DASI. También se puede realizar mediante ELISA directo o indirecto, utilizando microplacas no sensibilizadas, no tapizadas con anticuerpos.

Denominación común en español, que proviene del acrónimo del inglés “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, o ensayo inmunoenzimático en fase sólida o ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, popularmente ELISA. Da nombre a una técnica inmunológica o ensayo inmunoenzimático o serológico muy sensible para detectar, cuantificar, identificar o comparar antígenos complejos (agentes patógenos), proteínas, anticuerpos, péptidos u hormonas, incluso en extractos vegetales brutos. Esta prueba se caracteriza por utilizar un soporte insoluble o inmunoadsorbente (microplacas, tubos, pocillos o membranas) para fijar, tapizar o sensibilizar con antígenos o anticuerpos, según la modalidad de técnica. La prueba consiste en una serie de incubaciones mediadas por lavados, hasta adicionar el substrato. Se caracteriza porque la reacción se revela con anticuerpos conjugados enzimáticamente (frecuentemente en Patología vegetal con fosfatasa alcalina de mucosa intestinal de ternera y en ocasiones con peroxidasa de rábano picante) o biotinilados y un sustrato apropiado a la enzima marcadora (p-nitrofenil fosfato en el caso de la fosfatasa alcalina y peróxido de hidrógeno para la peroxidasa). La densidad óptica o valor ELISA final es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo detectado y permite asignar un valor numérico a la detección semicuantitativa. Se han diseñado distintas variantes o modalidades: ELISA directo, indirecto, de doble sándwich de anticuerpos (DAS), indirecto doble sándwich de anticuerpos (DASI), y competición. Las modalidades pueden realizarse con anticuerpos policlonales, con anticuerpos monoclonales, con anticuerpos recombinantes o con fragmentos F(ab´)2 de anticuerpo y proteína A conjugada. La técnica ELISA puede realizarse con sustratos solubles o precipitantes.

Variante de ELISA para valorar anticuerpos conjugados o para detectar antígenos. Sobre una microplaca (o un inmunoadsorbente) tapizada con antígeno, se añaden los anticuerpos específicos del antígeno, marcados con una enzima o biotinilados y se incuban. En la etapa final, tras añadir el sustrato se obtendrá un valor ELISA (densidad óptica) proporcional a la cantidad de enzima fijada, que sugerirá la dosis de conjugado a emplear, caso de que el mismo sea válido o se observará si ha existido reacción con la muestra tapizada en la que se deseaba detectar un patógeno concreto. Esta técnica está en desuso para la detección de antígenos (agentes patógenos) pues exige la preparación de conjugados para cada antígeno a detectar, problemática resuelta por ELISA indirecto.

Variante de ELISA muy sensible para detección de antígenos complejos (agentes patógenos). De manera secuencial y mediada por etapas de incubación y lavado, se tapizan los pocillos de una microplaca o la superficie de un inmunoadsorbente con anticuerpos purificados específicos del agente patógeno a detectar, se añade la muestra (extracto bruto vegetal, suspensión bacteriana, dilacerado, exudados, lloros de vid, extracto de suelo filtrado, etc.), y se añaden los mismos anticuerpos que en la primera etapa, pero conjugados con una enzima (habitualmente fosfatasa alcalina). La reacción se revela con el substrato específico de la enzima marcadora (habitualmente p-nitrofenil fosfato) que por hidrólisis y efecto batocrómico producirá un color amarillo (valor ELISA a 405 nm) de intensidad proporcional a la enzima retenida. La reacción clásica y más sensible, se realiza añadiendo 200 L/pocillo de la microplaca en cada etapa, aunque para ahorro de reactivos y economía algunos kits comerciales utilizan solo 100 L/pocillo. Otras modalidades utilizan únicamente unos microlitros Los anticuerpos utilizados para tapizar o como conjugados pueden ser producidos en la misma especie animal o no. Frecuentemente se utilizan anticuerpos policlonales para tapizado y monoclonales específicos (solos o en mezcla de varios) como conjugados, o ELISA basado completamente en anticuerpos policlonales, en anticuerpos monoclonales o recombinantes de anticuerpos monoclonales, que confieren alta especificidad y sensibilidad. DAS es la modalidad más popular de ELISA para detección de agentes patógenos o sus metabolitos.

Variante de ELISA para detectar antígenos o para titular anticuerpos, en la que se evita realizar conjugados de los anticuerpos específicos en laboratorio. El inmunoadsorbente o microplaca se tapiza con fragmentos F(ab’)2 de IgG obtenidos mediante una sencilla digestión de los anticuerpos con pepsina, el antígeno se detecta con anticuerpos completos (de la misma fuente u origen anterior o de diferente) y finalmente, la reacción se revela mediante proteína A conjugada con enzimas u otro producto para otras aplicaciones (la proteína A reacciona con la porción Fc de las inmunoglobulinas completas). La proteína A comercializada posee una calidad contrastada y es distribuida por numerosas empresas.

Variante de ELISA usada para detectar antígenos, establecer parentescos serológicos entre ellos o titular anticuerpos en diluciones seriadas. Sobre una microplaca o un inmunoadsorbente tapizado con antígeno (o muestra en la que desea verificar la presencia del antígeno de interés), se añaden los anticuerpos específicos del antígeno y tras incubación y lavado se añaden inmunoglobulinas anti la especie animal utilizada para obtener los anticuerpos específicos, marcadas con una enzima o biotiniladas Esta modalidad evita tener que preparar conjugados para cada anticuerpo específico y como quiera que las inmunoglobulinas anti especie son muy utilizadas en análisis clínicos, están disponibles comercialmente con una alta calidad contrastada. Las más usuales son las de cabra anticonejo para anticuerpos policlonales de antisueros o de cabra antirratón para anticuerpos monoclonales, marcadas con fosfatasa alcalina o peroxidasa.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

1. Vasija o pequeño recipiente empotrado en una superficie para recoger o contener un líquido. Receptáculo, generalmente cilíndrico e integrado en placas de poliestireno o polivinilo, las cuales se usan como parte de ensayos de diagnóstico e identificación, como las placas, generalmente de 96 pocillos de volumen máximo de 350 µL, usadas en reacciones de la técnica ELISA. El volumen de cada pocillo suele variar de 5 a 350 µL, según microplacas. 2. Aquellas rendijas o canales realizados en geles de agarosa para depositar la muestra. El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón en ebullición. A continuación, se deja enfriar la solución a 55 °C y se vierte en un soporte, donde se solidifica. Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón. Para preparar las muestras para la electroforesis, estas se mezclan con componentes que les agregan densidad, como el glicerol o la sacarosa. Estos proporcionan a las muestras más densidad que la del tampón de electroforesis. Las muestras pueden entonces colocarse por medio de una micropipeta en las rendijas visibles en el gel o pocillos, con la ayuda de una plantilla. Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en los pocillos.

Recipiente estándar en investigación y laboratorios de diagnóstico, de 127,6 x 85,75 mm, adaptado a la automatización y pipetas múltiples. Diseñada con 96 pocillos en forma de tubo de fondo plano, de capacidad máxima 350 L, aunque se fabrican de menor volumen/pocillo para técnicas ELISA de formato especial, Su formato es de 12 columnas de pocillos, numeradas de 1 a 12 y de ocho filas, marcadas con letras de A a H. Su fondo es generalmente plano para permitir lectura espectrofotométrica a través del contenido del pocillo (espesor estándar del fondo 1,20 mm), aunque existen disponibles de fondo en U y en V. Fabricada con poliestireno rígido de gran claridad (también está comercialmente disponible en policloruro de vinilo-PVC flexible o rígida). Las placas se distribuyen con o sin tapa, estériles o no, de alta o baja adherencia y empaquetadas individualmente o en otros formatos, generalmente de cinco placas/paquete.