Diccionario

Aquellas de diversos orígenes que son utilizadas como marcadores de expresión o localización por su propiedad de emitir fluorescencia una vez excitadas. Poseen la capacidad de agregarse en dímeros o tetrámeros que no es un inconveniente cuando la proteína se expresa libre. Todas las variantes disponibles comercialmente ofrecen buenos resultados destacando la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes: la versión mejorada de GFP (EGFP) también verde, con dos cambios aminoacídicos con respecto a la nativa, la proteína mejorada fluorescente amarilla (enhanced yellow fluorescent protein-EYFP) y otras. Además de las variantes de GFP, actualmente existen nuevas proteínas fluorescentes derivadas de anémona y coral, que amplían el abanico de elección y de posibilidades de esta tecnología, así la proteína azul fluorescente mejorada (enhanced blue fluorescent protein-EBFP), la proteína cian fluorescente mejorada (enhanced cyan fluorescent protein-ECFP) y la proteína amarilla fluorescente mejorada (enhanced yellow fluorescent protein-EYFP), entre otras.

Técnica que permite visualizar interacciones entre proteínas o la interacción proteína-macromolécula, basándose en el revelado de un complejo fluorescente. Se basa en la asociación de fragmentos de proteínas fluorescentes que se unen a componentes del mismo complejo macromolecular Las proteínas que se postulan que interactúan se fusionan con fragmentos complementarios desplegados de una proteína indicadora fluorescente y se expresan en células vivas. La interacción de estas proteínas acercará los fragmentos fluorescentes, lo que permitirá que la proteína informadora se reforme en su estructura tridimensional y emita su señal fluorescente. Esta señal se puede detectar y ubicar dentro de la célula utilizando un microscopio de fluorescencia invertido para lograr obtener imágenes de fluorescencia en las células vivas. La intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional a la fuerza de la interacción, con niveles más fuertes de fluorescencia que indican interacciones cercanas o directas y niveles más bajos de fluorescencia que sugieren interacción dentro de un complejo.

Aquellos basados en la emisión de fluorescencia por proteínas fluorescentes (PF) utilizadas como marcadores delatores. Constituyen una herramienta imprescindible Este tipo de marcadores ha revolucionado el marcaje celular ya que permiten detectar marcadores proteicos in vivo, en un entorno celular natural y sin previa manipulación del tejido, en contraposición con los marcadores enzimáticos. Posibilitan el análisis de procesos dinámicos subcelulares y la localización subcelular de proteínas de interés. Además de la proteína verde fluorescente (GFP), se han obtenido diversos marcadores fluorescentes, también derivados de corales y anémonas.

Compuesto conjugado o marcado que se introduce en un cultivo in vitro, o que se utiliza como sustrato para una reacción realizada in vitro, con el objetivo de seguir o monitorizar el crecimiento o el metabolismo de un compuesto determinado. Se utilizan frecuentemente trazadores radiactivos, fluorocromos o proteínas fluorescentes y otros.

Proteína aislada originalmente a partir de la medusa Aequorea victoria. La proteína verde fluorescente nativa tiene un tamaño de 27 kDa (238 residuos de aminoácido), absorbe luz azul con un máximo a 395 nm y emite luz verde con un máximo a 510 nm, tanto en organismos bioluminiscentes como en estado puro en solución. A diferencia de otros marcadores fluorescentes no requiere sustratos exógenos para emitir fluorescencia. Por sus propiedades fluorescentes y su relativa estabilidad, se ha convertido en el marcador más utilizado para la detección de la expresión génica y especialmente para la localización subcelular de proteínas. Es in vitro una proteína muy estable y resistente a altas temperaturas (tm=70 °C), a pH alcalino, a detergentes, a disolventes orgánicos y a las proteasas más comunes, con excepción de la pronasa. Soporta tratamientos con glutaraldehido lo que permite su observación en muestras fijadas para estudios de microscopía. Su fluorescencia se pierde si la proteína es desnaturalizada tras tratamientos a temperatura muy elevada, a pH extremos o tratamientos con cloruro de guanidina, y puede ser recuperada parcialmente si la proteína se renaturaliza. Se trata de un marcador ideal tanto para visualizar microorganismos como para determinar expresión génica, localizar proteínas a nivel subcelular o aplicarla a estudios de supervivencia bacteriana o fúngica; sus ventajas como marcador en bacterias se resumen en: i) es fácil de detectar; ii) no precisa sustrato exógeno; iii) permite visualizar células individuales; iv) permite un sencillo procesado de las muestras incluso en muestras fijadas si es necesario; v) ofrece la posibilidad de observar bacterias en su entorno natural, sin destruirlo y en tiempo real; vi) permite analizar células vivas y discriminarlas; vii) se puede utilizar en combinación con otros fluorocromos; y viii) no suele plantear problemas de ruido de fondo por autofluorescencia de las bacterias. Ha facilitado enormemente el estudio de las interacciones planta-patógeno y se utiliza en multitud de especies fitopatógenas como un marcador para caracterizar el proceso completo de colonización, para estudiar el patrón espacial de expresión génica y de localización proteica en distintos agentes patógenos. Ha permitido un extraordinario progreso en el conocimiento de los aspectos celulares y moleculares de las interacciones patógeno-huésped o anfitrión. Además, los organismos transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente pueden detectarse fácilmente en el interior de la planta sin ninguna intervención externa, proporcionando una valiosa información del desarrollo del patógeno dentro de la planta. Los cambios de secuencia realizados en el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) han dado lugar a numerosas variantes de excitación y de emisión, disponibles comercialmente.