Diccionario

Determinación del número de células en una población capaz de crecer y reproducirse (multiplicarse). En cultivos bacterianos un método sensible es el conteo de colonias visibles crecidas sobre un medio de cultivo sólido, a partir de la siembra de una dilución de una suspensión de baja concentración bacteriana, con el fin de lograr que cada célula se encuentre aislada y sea sencillo contar las colonias aparecidas en el medio utilizado. Cuando la concentración inicial es baja se suele proceder a filtrar la muestra a través de una membrana, para aumentar su concentración, que posteriormente se siembra en una placa de Petri. Se suele confundir viabilidad y cultivabilidad. El método descrito lo que calcula es el número de células cultivables en un medio determinado, pero no todas las células viables son cultivables. En otras ocasiones, puede valorarse la viabilidad celular, mediante: i) evaluación de la integridad de la membrana celular, mediante sustancias colorantes o fluorescentes, tinciones catiónicas o métodos basados en la liberación de sustancias al medio extracelular; ii) ensayos funcionales, como la cuantificación de los niveles de adenosín trifosfato (ATP), síntesis del nuevo ADN, o por detección de proteínas relacionadas con la proliferación celular; iii) métodos basados en biosensores de fluorescencia (marcadores de proteínas); iv) métodos según morfología celular; v) métodos de microanálisis por energía dispersiva de rayos X; vi) métodos de determinación de la expresión génica (microchips), o vii) mediante el uso de PCR cuantitativa con agentes intercalantes que únicamente permiten la detección de células viables, ya que solo pueden atravesar membranas celulares comprometidas y bloquear la amplificación.

Molécula de colorante impermeable a la membrana celular cuando esta se encuentra intacta, con alta afinidad por el ADN de doble cadena (ADNds) y fotorreactivo. Se utilizan básicamente la monoazida de etidio o monoazida de propidio, entre otras, que se intercalan en el ADNds de las bacterias muertas, que tienen sus membranas celulares comprometidas, mediante la formación de enlaces covalentes tras la exposición a una fuente de luz visible intensa e impiden así la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa (en tiempo real). El uso de agentes intercalantes supone teóricamente la ausencia de amplificación de bacterias muertas (no viables), y en la práctica retrasa la amplificación en poblaciones bacterianas constituidas por células íntegras y células comprometidas. Teóricamente, en una población constituida totalmente por células con sus membranas degradadas, no debería obtenerse amplificación molecular y, por tanto, se consideraría al patógeno bacteriano como no detectado. El uso de los colorantes intercalantes, combinado con PCR en tiempo real minimiza el riesgo de sobreestimación de células viables de bacterias patógenas, que son las que suponen un riesgo fitopatológico, que en ocasiones conduce a rechazos de material vegetal o sus productos en frontera o en estaciones de cuarentena.