Diccionario

Amplificación molecular de ácidos nucleicos que se realiza a temperatura constante, no precisando de un termociclador como en la PCR convencional, ya que permite la amplificación sin la necesidad de ciclos repetidos de desnaturalización e hibridación a diferentes temperaturas. Las diferentes técnicas de amplificación isotérmica se han popularizado para detectar un amplio espectro de dianas o blancos que incluyen no solo ADN y ARN, sino también proteínas, células, pequeñas moléculas e iones. Se utiliza como principio de funcionamiento en biosensores y en variados métodos de detección, diagnóstico e identificación. La amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), la de círculo rodante (RCA), la mediada por bucle o asa (LAMP) y NASBA son algunos ejemplos de técnicas de amplificación de ADN o ARN (RT-LAMP) que utilizan como principio la amplificación isotérmica. Aunque estas técnicas se basan principalmente en la replicación del ADN, la mayoría de estos métodos amplifican ácidos nucleicos utilizando cebadores diseñados con estrategias diferentes a las empleadas en la PCR. Además, pueden alcanzar una amplificación exponencial utilizando únicamente una ADN polimerasa (como el caso de LAMP) aunque algunas otras requieren enzimas o proteínas adicionales. Su desarrollo al margen de los circuitos comerciales interesados en explotar reactivos de PCR y sus termocicladores automáticos asociados, ha limitado su aplicación a pesar de su interés.

Técnica analítica recientemente aplicada para el diagnóstico de enfermedades de las plantas. Se basa en el estudio y comparación de curvas de fusión de las cadenas de ADN. Sus principales aplicaciones son la detección de mutaciones, polimorfismos y alteraciones epigenéticas en muestras de ADN. Este método tiene ventajas sobre la PCR convencional estándar, ya que no requiere la visualización de bandas de ADN ni el uso de las sondas necesarias para PCR cuantitativa. Esta nueva herramienta de diagnóstico en Fitopatología basada en amplificación molecular es capaz, por ejemplo, de detectar el hongo Colletotrichum abscissum en cítricos durante sus etapas asintomática y sintomática.

Técnica que permite el aumento exponencial in vitro del número de copias de un fragmento de ADN o de ARN particular. Las más empleadas actualmente en Fitopatología son las de amplificación de ADN por PCR convencional o en tiempo real o las isotérmicas como LAMP. Las técnicas de amplificación de ARN logran amplificar suficiente cantidad de ARNm que se suele emplear para realizar experimentos en microchips.

Denominación común del efectuado para detectar bacterias u otros organismos mediante un tampón apropiado o agua estéril absorbida a través de una sección de tallo o sarmiento, cuya base está depositada en un vaso de precipitado. El líquido se hace pasar a través del material vegetal por succión con una jeringa conectada a una goma elástica para asegurar la estanqueidad. Se han diseñado dispositivos manuales para la obtención de líquido de lavado interno de distintas muestras simultáneamente. También puede realizarse haciendo pasar líquido a través de la sección de material vegetal con ayuda de la presión realizada con una jeringa que contiene el líquido. Los primeros mililitros de líquido así obtenido se han utilizado para aislamiento, detección serológica (inmunofluorescencia o ELISA) o para amplificación molecular (PCR convencional o en tiempo real) de patógenos vasculares, como las especies bacterianas Xylophilus ampelinus o Xylella fastidiosa e incluso cepas tumorígenas de Allorhizobium vitis en vid.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Variante de la PCR convencional simple que comprende dos rondas de amplificación consecutivas, con distintos pares de cebadores (externos e internos a la secuencia diana), con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el fragmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica. Se efectúa consecutivamente en dos tubos distintos, implicando dicha operación serios riesgos de contaminación, pues supone abrir el tubo con los amplicones de la primera ronda para realizar la segunda ronda de amplificación. Para solventar el problema se han diseñado protocolos en un solo tubo cerrado. La PCR anidada supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de la PCR o RT-PCR convencional.

Procedimiento para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR o RT-PCR anidada o la semianidada en dos rondas consecutivas de amplificación en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación por aerosoles al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. Para solventar este problema, se desarrolló un sistema para la separación física de los cebadores externos e internos dentro de un mismo tubo, mediante el uso de la parte final de una punta de pipeta de 100 L en cuyo interior se deposita el segundo cóctel y donde se mantiene por capilaridad. Esta estrategia permite realizar las dos amplificaciones sin abrir o cambiar de tubo. Transcurrida la primera amplificación, es suficiente agitar levemente el tubo para que el segundo cóctel se mezcle con el resultado de la primera amplificación y, sin abrir el tubo, comience la segunda amplificación. La PCR anidada en un solo tubo cerrado supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de PCR o RT-PCR convencional y es interesante cuando no se dispone de otras opciones como PCR en tiempo real. También puede efectuarse la versión RT-PCR en un solo tubo cerrado.

Reacción de amplificación de ARN como en PCR convencional, que sigue los dos pasos siguientes: i) transcripción reversa o retrotranscripción del ARN para convertirlo en ADNc y ii) PCR convencional del ADNc con detección final de los amplicones.

Variación de la PCR convencional o simple que permite la amplificación molecular de segmentos de ADN de secuencia desconocida que flanquean segmentos de ADN de la secuencia conocida.