Diccionario

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Técnica de PCR que permite la amplificación de ADN o ARN cuando solo se conoce el extremo 3′ de la secuencia de interés. Por ejemplo, el extremo 5′ de la región a amplificar es artificialmente creado añadiendo una cola de nucleótidos definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un cebador 5′. A partir de aquí se realiza una PCR simple convencional. También puede efectuarse la versión RT-PCR anclada.

Variante de la PCR convencional simple que comprende dos rondas de amplificación consecutivas, con distintos pares de cebadores (externos e internos a la secuencia diana), con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el fragmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica. Se efectúa consecutivamente en dos tubos distintos, implicando dicha operación serios riesgos de contaminación, pues supone abrir el tubo con los amplicones de la primera ronda para realizar la segunda ronda de amplificación. Para solventar el problema se han diseñado protocolos en un solo tubo cerrado. La PCR anidada supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de la PCR o RT-PCR convencional.

Procedimiento para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR o RT-PCR anidada o la semianidada en dos rondas consecutivas de amplificación en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación por aerosoles al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. Para solventar este problema, se desarrolló un sistema para la separación física de los cebadores externos e internos dentro de un mismo tubo, mediante el uso de la parte final de una punta de pipeta de 100 L en cuyo interior se deposita el segundo cóctel y donde se mantiene por capilaridad. Esta estrategia permite realizar las dos amplificaciones sin abrir o cambiar de tubo. Transcurrida la primera amplificación, es suficiente agitar levemente el tubo para que el segundo cóctel se mezcle con el resultado de la primera amplificación y, sin abrir el tubo, comience la segunda amplificación. La PCR anidada en un solo tubo cerrado supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de PCR o RT-PCR convencional y es interesante cuando no se dispone de otras opciones como PCR en tiempo real. También puede efectuarse la versión RT-PCR en un solo tubo cerrado.

Variante de la PCR simple convencional que consiste en la amplificación preferencial de una de las cadenas del ADN diana. También puede efectuarse la versión RT-PCR asimétrica.

Método de PCR basado en la acción simultánea y coordinada de cuatro cebadores, que permite la detección de bacterias y virus de ARN, viroides y otros ARN transcritos, en su variante de RT-PCR. La reacción tiene lugar en un único cóctel y en un solo tubo cerrado. En el caso de RT-PCR, la transcripción reversa y simultánea de los fragmentos, la coordinación entre cebadores externos e internos y la cooperación de los amplicones a modo de cebadores o iniciadores son la base del método. Su sensibilidad es similar a la del PCR y RT-PCR anidada, que resulta ser 100 veces mayor que la obtenida con PCR o RT-PCR simples y utiliza 10 veces menos reactivos. Es una opción económica si no se dispone de termociclador para PCR en tiempo real. También puede realizarse la versión RT-PCR cooperativa.

Método que supone una modificación de la PCR simple convencional ya que permite cuantificar la cantidad inicial de un fragmento diana presente en la muestra original, ya sea ADN o ARN (ADNc). Las dos metodologías de PCR cuantitativa más frecuentemente utilizadas son actualmente: PCR en tiempo real y PCR digital. También es muy frecuente la versión RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR).

Reacción de amplificación de ARN como en PCR convencional, que sigue los dos pasos siguientes: i) transcripción reversa o retrotranscripción del ARN para convertirlo en ADNc y ii) PCR convencional del ADNc con detección final de los amplicones.

Reacción de PCR que se basa en el inicio de la reacción a temperaturas elevadas con el fin de evitar la amplificación de productos inespecíficos. Se logra mediante el uso de una enzima ADN polimerasa que solo se active a altas temperaturas. Puede efectuarse en su versión RT-PCR de arranque caliente.

Consiste en realizar una reacción de PCR de cada colonia bacteriana de un aislamiento u otra prueba, con el fin de detectar o rastrear las colonias que únicamente contienen la secuencia nucleotídica de interés.

Reacción de amplificación que permite generar un producto, de miles de pares de bases, mucho más extenso que mediante una PCR simple convencional. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de largo alcance.

Método de PCR para evitar que los cebadores amplifiquen secuencias no específicas. El procedimiento se basa en que la especificidad de los productos de la reacción depende de la temperatura de hibridación a la que se produce la misma. Cuanto menor es la temperatura, menor es la especificidad. Además, se basa en que la temperatura de fusión del ADN (Tm) de los iniciadores establece un límite superior a la temperatura de hibridación. Al mantener inicialmente la temperatura muy cerca de la temperatura de fusión de los cebadores, los productos más específicos se amplificarán primero y, por lo tanto, no serán absorbidos por los productos no específicos a medida que se reduce la temperatura de la reacción. Además, la amplificación inicial hace que haya más dianas de la secuencia específica disponible para la amplificación, lo que también ayuda a superar a los productos no específicos. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de toma de contacto.

Método de identificación de genes expresados de manera diferencial, mediante la comparación de secuencias de ADNc amplificadas por PCR. Permite una detección sensible, rápida y precisa de eventuales modificaciones en el patrón de expresión génica.

Variante que se diferencia de una PCR simple o convencional estándar en que utiliza un conjunto de cebadores con secuencias degeneradas en vez de un solo par de cebadores de secuencia única. Permite amplificar genes nuevos y familias multigénicas. Constituye una herramienta clave en estudios evolutivos a nivel molecular. Se basa en el diseño de un cebador degenerado con el fin de detectar o encontrar un gen a partir de secuencias de ADN disponibles de otros organismos estrechamente relacionados. También es muy frecuente la versión RT-PCR degenerada.

Tecnología similar a la PCR en tiempo real, pero que se basa en la separación de la muestra inicial en gran cantidad de alícuotas que son amplificadas individualmente y permite la cuantificación precisa y absoluta del producto amplificado. Se obtiene mayor sensibilidad que con PCR en tiempo real, hay menor efecto negativo de inhibidores y requiere baja cantidad de reactivos, pero los equipos y reactivos tienen en la actualidad un coste más elevado. También es frecuente la versión RT-PCR digital.

Tecnología de última generación derivada de la PCR digital, que está siendo utilizada en distintos campos científicos para la cuantificación de ADN, mostrándose como una técnica más sensible que la PCR en tiempo real. Permite una cuantificación absoluta del ADN de organismos en muestras ambientales. Es una forma digital del método de PCR que utiliza un sistema de emulsión de agua y aceite. Esta técnica divide las muestras de ácido nucleico en miles de gotas de un volumen de pocos nanolitros. Luego, la amplificación por PCR se realiza dentro de cada gota y, por lo tanto, requiere menos muestra que otros tipos de PCR. Se ha aplicado a hongos asociados a la enfermedad del pie negro y a la detección de Ilyonectria liriodendri (sin. Cylindrocarpon liriodendri) y de numerosos organismos de cuarentena. También puede aplicarse en su versión RT-PCR digital de gotas.

Variante de la técnica de PCR simple convencional donde se emplean dos pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente dos segmentos distintos de ADN. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de dos aislados o cepas del mismo patógeno o de dos patógenos diferentes, incluso si son de ADN y ARN. También es frecuente la PCR múltiple y la versión RT-PCR dúplex.

Método que permite monitorear la reacción de PCR o RT-PCR durante el proceso de amplificación, posibilitando la detección y cuantificación del organismo diana en la muestra en un único proceso realizado en placas o tubos. En teoría, hay una relación cuantitativa entre la cantidad de la secuencia diana inicial y la cantidad del producto amplificado en cualquier ciclo de la amplificación. Mediante la inclusión de fluorocromos se puede monitorizar el progreso de la reacción de amplificación en tiempo real, midiendo la fluorescencia liberada cada vez que se realiza una copia del ADN molde, puesto que el incremento de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN generado. Al permitir el seguimiento de la reacción en tiempo real, se elimina la necesidad de manipular los amplificados en pasos de post-PCR, disminuyendo riesgos de contaminación entre muestras por aerosoles. La posibilidad de poder cuantificar las dianas la convierte, además, en una herramienta útil para determinar los niveles de inóculo en la muestra. Las técnicas de amplificación molecular en tiempo real se han convertido en las de referencia para diagnóstico y detección. Para el diseño de protocolos de detección mediante PCR en tiempo real se recomienda que los productos amplificados o amplicones sean de pequeño tamaño (80-150 pb), para poder alcanzar resultados óptimos en sensibilidad, especificidad y eficiencia. La posibilidad de utilizar sondas marcadas con distintas moléculas fluorescentes permite utilizar las técnicas de PCR o RT-PCR en tiempo real en formato múltiple. Sus aplicaciones son diversas además de la detección de patógenos y determinación de la carga viral, se usan en estudios de expresión génica (cuantificación absoluta con curva patrón y cuantificación relativa con gen control endógeno), detección de SNP, o estudios de discriminación alélica, entre otras. La técnica permite procesar muestras compuestas preparadas por métodos directos, en menos de 2 h. También es muy utilizada en la versión RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR).

PCR que se basa en una reacción de amplificación en células o en secciones de tejidos. Los productos de PCR generados pueden visualizarse localizados en el lugar donde se produjo la amplificación. También es utilizada en la versión RT-PCR in situ.

Variante de PCR que permite realizar una amplificación de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN del que solo se conoce parte de su secuencia interna. El ADN genómico que contiene la secuencia nucleotídica flanqueada (en inglés, core region) se digiere por completo con una enzima de restricción que lo escinde en una serie de fragmentos dejando intacta dicha secuencia y las lindantes. Originalmente estos fragmentos no podían exceder de dos o tres kilobases de extensión. Los fragmentos lineales se circularizan (transforman en círculos) con una ADN-ligasa en condiciones que favorecen la formación de círculos monoméricos (compuestos de un solo fragmento y no de varios fragmentos concatenados) y se amplifican con dos iniciadores que son complementarios de sendos extremos de la secuencia conocida, pero cuyos extremos 3’ apuntan hacia fuera de la región comprendida por ambos, a la inversa de lo que sucede en la PCR simple normal, de modo que lo que se amplifica son las secuencias flanqueantes (y no la flanqueada). El producto de esta reacción en cadena será, pues, una molécula lineal de ADN bicatenario constituida por ambas secuencias flanqueantes dispuestas una a continuación de la otra, según el Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas, de página electrónica: www.medtrad.org/panacea.html.

Variante de la técnica de PCR simple convencional en la que se emplean dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Permite detectar ADN de dos o más patógenos en la misma muestra. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de distintos aislados o cepas del mismo patógeno o combinaciones de estos con otros patógenos diferentes, incluso de ADN y ARN simultáneamente, siendo muy frecuente la versión RT-PCR múltiple.

La PCR o RT-PCR semianidada utiliza dos cebadores externos y un único cebador interno. Este procedimiento permite aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR simple convencional. Generalmente, las amplificaciones se realizan en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. La versión RT-PCR semianidada es muy utilizada.

PCR eficaz para amplificar secuencias desconocidas adyacentes a sitios de inserción conocidos en Arabidopsis y aplicable a otros modelos. La reacción comienza con ciclos térmicos de PCR y un par de iniciadores que están relativamente separados. A continuación, se agrega un cebador adicional o un par de cebadores (anidados) que unen la secuencia entre el primer conjunto de cebadores (cebadores externos), con diferentes temperaturas de hibridación. Se agregan en concentraciones más altas que los cebadores externos, de modo que después de unos pocos ciclos de reacción gobiernen y generen más productos de PCR que los otros cebadores. Esta técnica es útil cuando se desea mapear dónde se ha insertado el ADN de transferencia en un genoma.

Técnica alternativa a la PCR que aplica electroforesis capilar para determinar las longitudes de los amplicones, en lugar de la secuenciación del ADN como en el código de barras de ADN. Se obtiene un patrón de migración que permite la detección de varios picos característicos de muestras multiespecíficas.

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

Sustancias o compuestos utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permiten optimizar e incluso potenciar las condiciones de la reacción de amplificación molecular de los ácidos nucleicos. Existe una amplia lista potencial como 2-pirrolidona, acetamida, propionamida, formamida, dimetilsulfóxido, albúmina de suero bovino, polietilenglicol, cloruro potásico o detergentes no iónicos, entre otros. Se recomienda probar empíricamente cada uno de ellos en cada sistema concreto, para verificar su utilidad.

Contaminante orgánico e inorgánico incluido en la muestra de ADN o ARN que interfiere atenuando o inhibiendo completamente la reacción de amplificación por PCR o RT-PCR. La mayoría frecuentemente provienen de la muestra vegetal, del suelo o de la muestra de artrópodos analizada. Pero también pueden proceder del propio operador o del material y tampones utilizados para la amplificación, que han sido contaminados por el operador. Existe una amplia gama de métodos y protocolos y normas o precauciones de trabajo para reducirlos y de kits comerciales que eliminan o reducen significativamente los distintos inhibidores procedentes de la muestra.

Mezcla que contiene todos los componentes necesarios para una reacción de amplificación molecular mediante PCR. Disponible comercialmente este producto está diseñado para disminuir tiempos en la preparación de la reacción de PCR y evitar contaminaciones en las etapas de pipeteo. Es una solución premezclada en agua destilada libre de ADNasas y que contiene ADN polimerasa Taq, dNTPs, MgCl2 y tampones de reacción en concentraciones óptimas para una amplificación eficiente de las dianas de ADN mediante PCR.

Proceso que radica en el ajuste de las condiciones de amplificación (temperaturas y tiempos de desnaturalización, hibridación de cebadores o iniciadores y extensión y en el número de ciclos) junto a las concentraciones y los componentes de la reacción, con el fin de obtener patrones nítidos y reproducibles de los productos de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) en distintos termocicladores.

Productos incluidos en una reacción de PCR para mejorar la amplificación, especialmente de segmentos de ADN complejos o largos difíciles de amplificar. Se componen de una amplia gama de compuestos que incluyen detergentes no iónicos, moléculas orgánicas, amidas de bajo peso molecular y codisolventes. Potenciadores como la betaína, el dimetilsulfóxido (DMSO), la formamida y el ditiotreitol (DTT), se utilizan comúnmente para mejorar los rendimientos.

Acrónimo.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa o reversa. Técnica de laboratorio comúnmente utilizada para generar copias de ADN partiendo de dianas de ARN. Se usa una enzima llamada retrotranscriptasa que convierte un segmento específico de ARN en un fragmento complementario de ADN. Luego, otra enzima llamada ADN polimerasa amplifica (produce en grandes cantidades) ese segmento de ADN. En el caso de que se utilice la técnica para evaluar actividad de transcripción, las copias de ADN amplificadas ayudan a identificar si hay un gen que produce la molécula específica de ARNm. Es posible usar la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción para detectar ciertos cambios en un gen o cromosoma, o para identificar la activación de ciertos genes, lo que ayuda a diagnosticar enfermedades, y para el estudio del ARN de ciertos virus (la gran mayoría de virus fitopatógenos poseen genoma de ARN). Posee las mismas variantes de reacción que la PCR.

En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, número de ciclos a partir del cual se comienza a detectar la fluorescencia emitida, por encima del ruido de fondo de la reacción.

Molécula de colorante impermeable a la membrana celular cuando esta se encuentra intacta, con alta afinidad por el ADN de doble cadena (ADNds) y fotorreactivo. Se utilizan básicamente la monoazida de etidio o monoazida de propidio, entre otras, que se intercalan en el ADNds de las bacterias muertas, que tienen sus membranas celulares comprometidas, mediante la formación de enlaces covalentes tras la exposición a una fuente de luz visible intensa e impiden así la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa (en tiempo real). El uso de agentes intercalantes supone teóricamente la ausencia de amplificación de bacterias muertas (no viables), y en la práctica retrasa la amplificación en poblaciones bacterianas constituidas por células íntegras y células comprometidas. Teóricamente, en una población constituida totalmente por células con sus membranas degradadas, no debería obtenerse amplificación molecular y, por tanto, se consideraría al patógeno bacteriano como no detectado. El uso de los colorantes intercalantes, combinado con PCR en tiempo real minimiza el riesgo de sobreestimación de células viables de bacterias patógenas, que son las que suponen un riesgo fitopatológico, que en ocasiones conduce a rechazos de material vegetal o sus productos en frontera o en estaciones de cuarentena.

Conjunto de moléculas de ADN idénticas que resulta de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o cualquier otro proceso que dé lugar a la producción de diferentes copias de ese fragmento concreto. Es esencialmente un clon molecular.

Aquella que utiliza cebadores de PCR cortos (alrededor de 10 bases) con secuencias arbitrarias y a bajas temperaturas de apareamiento. Hay descritos gran número de cebadores disponibles y es fácil de realizar, pero tiene ciertas limitaciones de reproducibilidad.

Técnica prácticamente universal para generar patrones de amplificación de DNA para el tipado e identificación de diversas especies de bacterias. Están disponibles protocolos generales descritos por EPPO (2010 y 2014). Se realiza mediante la técnica denominada rep-PCR que se basa en la amplificación de secuencias repetitivas, específicas y conservadas, presentes en múltiples copias en los genomas de la mayoría de las bacterias gramnegativas y positivas, como las secuencias extragénicas palindrómicas repetitivas (REP), las secuencias intergénicas consenso y repetidas de enterobacterias (ERIC), las secuencias repetitivas y conservadas de las subunidades BOX A de los elementos BOX de Streptococcus pneumoniae, etc., con la finalidad de identificar bacterias muy distintas. En la mayoría de los casos, la utilización de estos cebadores da lugar a patrones de amplificación a pesar de que los organismos diana no contengan las repeticiones correspondientes (ERIC, BOX, etc.), por lo que en general se considera que es una PCR arbitraria.

Técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que no precisa de ciclos de temperaturas para la desnaturalización de las hebras de ADN, ya que, debido a la acción de enzimas de restricción que generan mellas en el ADN, este proceso se realiza de forma enzimática. Es una modificación de la PCR o RT-PCR simple convencional que mejora su rendimiento final. Se basa en la capacidad de una ADN polimerasa modificada, para desplazar una hebra monocatenaria resultante de un corte en una región específica y a partir de esta hebra desplazada, iniciar la replicación o amplificación de ese ADN diana. Con este procedimiento, las hebras desplazadas sirven como molde para los nuevos ciclos de amplificación, generando por un lado que los productos de amplificación se multipliquen por más del doble al final de cada ciclo de amplificación y por otro, que se observe un incremento en la velocidad de reacción, sensibilidad y especificidad de la técnica respecto a la PCR o RT-PCR simple convencional. Se puede llevar a cabo la replicación, amplificación o la secuenciación de un ADN mediante una ADN polimerasa del tipo fago φ29 o 29 (Phi29). Se realiza en un único tubo, lo que contribuye a evitar contaminaciones, en plataformas convencionales de la PCR cuantitativa, con un mayor número y concentración de cebadores. Incrementa la eficiencia y sensibilidad de la PCR, y se efectúa aumentando la velocidad final de la reacción.

Amplificación molecular de ácidos nucleicos que se realiza a temperatura constante, no precisando de un termociclador como en la PCR convencional, ya que permite la amplificación sin la necesidad de ciclos repetidos de desnaturalización e hibridación a diferentes temperaturas. Las diferentes técnicas de amplificación isotérmica se han popularizado para detectar un amplio espectro de dianas o blancos que incluyen no solo ADN y ARN, sino también proteínas, células, pequeñas moléculas e iones. Se utiliza como principio de funcionamiento en biosensores y en variados métodos de detección, diagnóstico e identificación. La amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), la de círculo rodante (RCA), la mediada por bucle o asa (LAMP) y NASBA son algunos ejemplos de técnicas de amplificación de ADN o ARN (RT-LAMP) que utilizan como principio la amplificación isotérmica. Aunque estas técnicas se basan principalmente en la replicación del ADN, la mayoría de estos métodos amplifican ácidos nucleicos utilizando cebadores diseñados con estrategias diferentes a las empleadas en la PCR. Además, pueden alcanzar una amplificación exponencial utilizando únicamente una ADN polimerasa (como el caso de LAMP) aunque algunas otras requieren enzimas o proteínas adicionales. Su desarrollo al margen de los circuitos comerciales interesados en explotar reactivos de PCR y sus termocicladores automáticos asociados, ha limitado su aplicación a pesar de su interés.

Método que emplea la ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 y cebadores al azar para la amplificación de moléculas de ADN. Constituye una alternativa eficaz y rápida para la detección de virus de genoma monopartito de ADN circular de cadena sencilla, incluyendo posibles nuevas variantes, al tratarse de una técnica que no precisa del conocimiento previo de la secuencia viral. Se han propuesto protocolos estandarizados EPPO para diagnóstico y detección de Begomovirus (familia Geminiviridae), que incluyen un análisis serológico inicial y una PCR para confirmar la infección.

Técnica de amplificación molecular isotérmica muy sensible, específica y selectiva, que se basa en la utilización de tres proteínas: una recombinasa, una proteína de unión a ADN monocatenario (proteína SSB, o single-stranded DNA-binding protein) y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra (strand displacement). La recombinasa forma un complejo nucleoproteico con el cebador en presencia de ATP y de un agente concentrador, como polietilenglicol; este complejo se une a la secuencia de ADN homóloga al cebador y favorece la desnaturalización local del ADN. Las regiones de cadena única se estabilizan mediante unión de la proteína SSB y, al disociarse la recombinasa del ADN, la ADN polimerasa se une al extremo 3’ del cebador e inicia la síntesis de ADN en presencia de dNTPs. La repetición cíclica de este proceso da lugar a una amplificación exponencial del ADN a una temperatura de 37–42 °C, sin requerir ciclos térmicos como la PCR. La técnica es robusta, pues puede amplificar con una preparación mínima de la muestra y permite utilizar extractos crudos, brutos o muy poco procesados. Permite producir una cantidad detectable de ADN amplificado en unos 20 minutos y partiendo de 1–10 copias del ADN diana. Se ha utilizado para amplificar ARN, ARNmi, ADN monocatenario (ssDNA) y ADN bicatenario (dsDNA) de una amplia variedad de organismos y muy distintas muestras. Se utiliza en detección de agentes fitopatógenos, genómica y biotecnología. Esta técnica, para detección del oomiceto Phytophthora pini, se ha combinado con un sistema de detección visual mediante un dispositivo de flujo lateral, lo que permite identificar la presencia del patógeno de forma sencilla. Combinado con CRISPR-Cas12a, conocida por su capacidad de edición genética y detección de secuencias específicas de ADN, permite la detección precisa, con alta sensibilidad, de secuencias diana.

Técnica analítica recientemente aplicada para el diagnóstico de enfermedades de las plantas. Se basa en el estudio y comparación de curvas de fusión de las cadenas de ADN. Sus principales aplicaciones son la detección de mutaciones, polimorfismos y alteraciones epigenéticas en muestras de ADN. Este método tiene ventajas sobre la PCR convencional estándar, ya que no requiere la visualización de bandas de ADN ni el uso de las sondas necesarias para PCR cuantitativa. Esta nueva herramienta de diagnóstico en Fitopatología basada en amplificación molecular es capaz, por ejemplo, de detectar el hongo Colletotrichum abscissum en cítricos durante sus etapas asintomática y sintomática.

Técnica de biología molecular muy utilizada en detección, diagnóstico e identificación, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría, basta partir de una única copia de ese fragmento original o molde. Utiliza la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), desarrollada en 1983 por Kary Mullis.