Diccionario

Esteroide que se encuentra exclusivamente en las flores y las hojas de las especies Digitalis purpurea, D. orientalis y D. lanata. Es un hapteno que se utiliza frecuentemente como molécula señal o marcador en inmunología e hibridación molecular, para el revelado de reacciones como otros marcadores (biotina o fluoresceína). Habitualmente, la digoxigenina se introduce químicamente por conjugación, en biomoléculas (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos) para ser detectados en ensayos adicionales. Son muy populares los anticuerpos anti-digoxigenina, ya que se utilizan en una extensa gama de ensayos inmunológicos como ELISA, electrotransferencias, etc. e hibridaciones moleculares e hibridación in situ y confieren gran sensibilidad a la reacción. De hecho, el uso de precursores no radiactivos para marcar ácidos nucleicos ha hecho a la hibridación molecular más accesible. El precursor no radioactivo más utilizado son los derivados de la molécula DIG, que está unido a través de un brazo espaciador (once residuos de carbono) a uridín-nucleótidos, y se incorpora enzimáticamente en los ácidos nucleicos mediante métodos estándar.

Técnica basada en la utilización de sondas de ADN para detectar (y, a veces, cuantificar) genes o secuencias nucleotídicas específicas y localizar dichos genes o secuencias en cromosomas metafásicos o núcleos en interfase. En este caso, la sonda (ADN o ARN) se marca por conjugación química directa con un fluorocromo, usualmente de la clase de las cumarinas, fluoresceínas, rodaminas o cianinas, o bien por conjugación química con una molécula no fluorescible, como la biotina o un hapteno (por ejemplo la digoxigenina o el dinitrofenol), capaz a su vez de unirse posteriormente a una segunda molécula marcada con un fluorocromo, como la avidina, en el caso de la biotina, o a un anticuerpo específico, en el caso del hapteno. Tras la hibridación y los lavados respectivos, la sonda se irradia, el fluorocromo emite luz de una determinada longitud de onda (y por consiguiente de un determinado color) y ello permite distinguir la secuencia complementaria como una mancha de color vivo al microscopio de fluorescencia, según definición del Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas (www.medtrad.org/panacea.html).

Denominación común de la hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN), que en el campo de la Patología Vegetal se aplica con frecuencia a la detección e identificación de patógenos de vegetales. Su potencial como herramienta de diagnóstico se demostró primero para la detección de viroides y posteriormente para virus. Asociación de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar una cadena doble que contenga dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una de ADN y una de ARN. Se emplea para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Se basa en la interacción específica entre las bases púricas y pirimidínicas complementarias que forman pares A-T y G-C, lo que resulta en un híbrido estable formado por parte, o la totalidad, de la secuencia del ácido nucleico del patógeno a detectar (molécula diana) y en la secuencia complementaria marcada (sonda). La estabilidad del híbrido depende del número de enlaces de hidrógeno formado y de las fuerzas electrostáticas e hidrófobas. Las fuerzas electrostáticas son debidas a las moléculas de fosfato del esqueleto del ácido nucleico, mientras que las interacciones hidrofóbicas se mantienen entre las bases apiladas. La detección de agentes fitopatógenos, como los virus, se realiza mediante la unión del ácido nucleico del genoma viral con moléculas de ácido nucleico complementario (sonda), que han sido marcadas con un isótopo radiactivo u otra molécula no radiactiva, como la biotina, avidina, proteína A, digoxigenina, proteína verde fluorescente-GFP, etc., que permite detectar, localizar, incluso valorar de forma cuantitativa, la hibridación ocurrida. Los principales factores que afectan a la reacción de hibridación son: la longitud y la composición de bases de la sonda, la temperatura, la concentración de sales, el pH, la concentración de formamida y el grado de identidad entre muestra y sonda. Las técnicas más usadas son: hibridación en fase sólida, Southern blot, Northern blot, hibridación dot-blot, hibridación con polisondas e hibridación in situ.

Método de marcado de los ácidos nucleicos para su utilización como sonda no radiactiva. Se une a la sonda un grupo que no perjudique su capacidad de hibridarse con las secuencias complementarias. Tras la hibridación, el dúplex marcado por afinidad reacciona con una molécula señal que contiene un sitio de unión para el marcador. Como moléculas señal suelen utilizarse, entre otras, anticuerpos fluorescentes o conjugados con digoxigenina, enzimas que producen cambios de color, catalizadores quimioluminiscentes, y la proteína verde fluorescente (GFP).

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

Sonda de ARN, utilizada frecuentemente para detectar patógenos. Se sintetizan mediante la incorporación de digoxigenina (DIG) en un ARNc por medio de una reacción de transcripción in vitro a partir de ADNc viral o viroidal clonado. Las muestras (ácidos nucleicos) se fijan a una membrana de nilón cargada positivamente, mediante tratamiento de 2 horas a 80 o a 120 °C durante 30 minutos, o por tratamiento con luz ultravioleta (UV). La fijación por tratamiento con UV aumenta de cinco a 10 veces, la fijación respecto a los tratamientos con calor.

Muestra o porción de ácido nucleico (ADN o ARN) de origen y, generalmente, secuencia conocida, que se marca o conjuga con una sustancia delatora para ser posteriormente reconocida. Generalmente se suelen marcar con isótopos radioactivos, inmunomarcadores como biotina, proteína A, avidina, estreptavidina, digoxigenina, etc., o marcadores de color o fluorescencia.

Denominación común de la transferencia tipo Southern, hibridación realizada sobre fragmentos de ADN transferidos a una membrana; el método recibió este nombre en honor a su inventor, Edwin Southern. El ADN intacto (por ejemplo, un perfil de plásmidos) o digerido con una enzima de restricción es separado electroforéticamente por tamaño en un gel, tras lo que se procede a una depurinación (para facilitar la transferencia de fragmentos largos) y desnaturalización de los fragmentos de ADN de doble cadena en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro, frecuentemente de nitrocelulosa, éster de celulosa o nailon, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. El filtro se incuba durante un tiempo con una sonda de ADNss o ARN marcada (radiactivamente, con digoxigenina o con un fluorocromo, entre otros); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas, mediante revelado con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina para sondas marcadas con digoxigenina o con una película sensible a la luz para el caso de sondas marcadas con un fluorocromo. Las hibridaciones con sondas marcadas con digoxigenina pueden revelarse también utilizando un sustrato quimioluminiscente, que es degradado por la fosfatasa alcalina y que emite luz; esta luz puede ser captada por una película o digitalmente por una cámara apropiada.

También denominada vitamina H, vitamina B7, vitamina B8 (aunque este nombre también se ha asignado a otros compuestos) o coenzima R, es una vitamina soluble en agua. Juega un papel relevante en el metabolismo de carbohidratos, proteínas y grasas. Es muy utilizada como marcador para revelar reacciones inmunológicas o serológicas, y en hibridación molecular para localizar secuencias de ADN in situ gracias a su gran avidez por la avidina, que puede estar marcada o conjugada con sustancias o productos delatores.