Diccionario

Población inicial de un hongo, bacteria u otro microorganismo aislado en condiciones controladas, utilizada como punto de partida para su multiplicación, estudio, diagnóstico, identificación o ensayos de patogenicidad. En un contexto más amplio, es la muestra o población microbiana inicial, pura y controlada, utilizada para iniciar un proceso de fermentación, multiplicación o producción en condiciones de laboratorio o industriales.

El enzima primasa hace un iniciador de ARN, un corto segmento de ácido nucleico complementario al molde, que proporciona un extremo 3′ con el que la ADN polimerasa puede trabajar. Un cebador típico es de cinco a diez nucleótidos de largo. El cebador o iniciador ceba la ADN polimerasa, es decir, le proporciona lo que necesita para funcionar. Una vez que el cebador de ARN está en su sitio, la ADN polimerasa lo extiende, añadiendo nucleótidos uno a uno para hacer una cadena nueva de ADN complementaria a la cadena molde.

Acrónimo del inglés. En español, herramienta básica de búsqueda de alineación local, un algoritmo utilizado para la comparación de secuencias, como las de nucleótidos de ADN o las de aminoácidos de proteínas, con el fin de encontrar regiones similares entre dos secuencias y deducir relaciones de homología. Generalmente, las búsquedas se realizan utilizando bases de datos públicas que pueden contener millones de secuencias, aunque también es posible realizar búsquedas utilizando bases de datos construidas por el usuario. El programa usa un algoritmo heurístico seguido de una búsqueda por programación dinámica (de Smith-Waterman, modificada), por lo que ofrece una búsqueda muy rápida y encuentra soluciones satisfactorias, aunque no puede garantizar que haya encontrado la solución óptima. Además, el programa calcula diversos parámetros, como bit-score y E-value, que permiten evaluar la probabilidad de que el alineamiento sea fruto del azar teniendo en cuenta la longitud de la secuencia problema y el tamaño de la base de datos. Existen distintos tipos de programas BLAST para el análisis de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos; dependiendo del tipo de secuencia problema y de la base de datos utilizada, estos programas son (secuencia problema/base de datos): blastn y megablast, nucleótidos/nucleótidos; blastp, proteínas/proteínas; blastx, nucleótidos traducidos en las seis pautas/proteínas; tblastn, proteína/nucleótidos traducidos en las seis pautas; tblastx, nucleótidos traducidos en las seis pautas/nucleótidos traducidos en las seis pautas. Igualmente, existen algoritmos especializados de blastp, como PSI-BLAST o DELTA-BLAST, que son más rápidos o más sensibles, o que permiten buscar patrones. Generalmente el primer paso en el diseño de iniciadores consiste en el alineamiento de las secuencias de interés mediante el programa Advanced BLAST diseñado para el análisis de nucleótidos, que facilita la selección de regiones conservadas para el diseño de iniciadores y sondas adecuados para detección. La implementación de BLAST más utilizada es la que aloja el National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Intermediario obligatorio en la síntesis de proteínas, compuesto por una subunidad ribosómica pequeña, ARNm, ARNt iniciador y las proteínas IF1, IF2 e IF3.

Proceso llevado a cabo mediante el uso de pequeñas cantidades de reactivos o de antígenos control, anticuerpos, conjugados, iniciadores, etc., para evaluar la naturaleza de los productos o las características de la reacción o de un posible estuche de diagnóstico o detección.

1. Patógeno, sus constituyentes o material vegetal infectado (espora de hongo, micelio, célula bacteriana, nematodo, virión, viroide, ARN, ADN, tejido, yema, etc.) utilizado para inocular y provocar infección o enfermedad en plantas, o para inocular medios de cultivo sólidos o líquidos. 2. Agente patógeno potencialmente infectivo presente en el ambiente o útiles de trabajo, con el cual sucede la inoculación natural no intencionada, de un huésped o anfitrión susceptible. 3. Parte alícuota de un cultivo en suspensión que se transfiere a un volumen superior de medio para su cultivo en una escala mayor. Constituye el cultivo iniciador de un microrganismo o mezcla de microorganismos, añadido a un medio de cultivo sintético en un fermentador para incrementar su población.

Conjunto de productos y utensilios suficientes para conseguir un determinado fin o realizar un procedimiento concreto de análisis, diagnóstico, detección o identificación, que se comercializan como una unidad con fecha de preparación y de caducidad. Además de los mencionados, se comercializan muchos kits para procedimientos muy diversos, como para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos, plásmidos, o diversos tests fenotípicos, secuenciación, o identificación de células viables, que son especialmente importantes en Fitopatología. Existen kits completos que permiten realizar enteramente las operaciones de diagnóstico, detección o identificación, directa o indirecta de un patógeno. En ellos se proporcionan testigos, tampones y los diversos componentes en las proporciones adecuadas, envasados de manera que se obtenga el mejor rendimiento de los componentes costosos o difíciles de obtener. Algunos componentes pueden comercializarse incluso prepesados, parcialmente prefabricados o ligados a soportes sólidos, con el fin de evitar las etapas preparativas. Existen también kits parciales que contienen únicamente los reactivos clave (anticuerpos, conjugados, sondas, iniciadores, tampones, etc.) para el fin perseguido. De cara a ser aceptados e incluidos en estándares internacionales de diagnóstico, requieren su homologación y validación.

Proceso que radica en el ajuste de las condiciones de amplificación (temperaturas y tiempos de desnaturalización, hibridación de cebadores o iniciadores y extensión y en el número de ciclos) junto a las concentraciones y los componentes de la reacción, con el fin de obtener patrones nítidos y reproducibles de los productos de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) en distintos termocicladores.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Método de PCR basado en la acción simultánea y coordinada de cuatro cebadores, que permite la detección de bacterias y virus de ARN, viroides y otros ARN transcritos, en su variante de RT-PCR. La reacción tiene lugar en un único cóctel y en un solo tubo cerrado. En el caso de RT-PCR, la transcripción reversa y simultánea de los fragmentos, la coordinación entre cebadores externos e internos y la cooperación de los amplicones a modo de cebadores o iniciadores son la base del método. Su sensibilidad es similar a la del PCR y RT-PCR anidada, que resulta ser 100 veces mayor que la obtenida con PCR o RT-PCR simples y utiliza 10 veces menos reactivos. Es una opción económica si no se dispone de termociclador para PCR en tiempo real. También puede realizarse la versión RT-PCR cooperativa.

Método de PCR para evitar que los cebadores amplifiquen secuencias no específicas. El procedimiento se basa en que la especificidad de los productos de la reacción depende de la temperatura de hibridación a la que se produce la misma. Cuanto menor es la temperatura, menor es la especificidad. Además, se basa en que la temperatura de fusión del ADN (Tm) de los iniciadores establece un límite superior a la temperatura de hibridación. Al mantener inicialmente la temperatura muy cerca de la temperatura de fusión de los cebadores, los productos más específicos se amplificarán primero y, por lo tanto, no serán absorbidos por los productos no específicos a medida que se reduce la temperatura de la reacción. Además, la amplificación inicial hace que haya más dianas de la secuencia específica disponible para la amplificación, lo que también ayuda a superar a los productos no específicos. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de toma de contacto.

Variante de PCR que permite realizar una amplificación de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN del que solo se conoce parte de su secuencia interna. El ADN genómico que contiene la secuencia nucleotídica flanqueada (en inglés, core region) se digiere por completo con una enzima de restricción que lo escinde en una serie de fragmentos dejando intacta dicha secuencia y las lindantes. Originalmente estos fragmentos no podían exceder de dos o tres kilobases de extensión. Los fragmentos lineales se circularizan (transforman en círculos) con una ADN-ligasa en condiciones que favorecen la formación de círculos monoméricos (compuestos de un solo fragmento y no de varios fragmentos concatenados) y se amplifican con dos iniciadores que son complementarios de sendos extremos de la secuencia conocida, pero cuyos extremos 3’ apuntan hacia fuera de la región comprendida por ambos, a la inversa de lo que sucede en la PCR simple normal, de modo que lo que se amplifica son las secuencias flanqueantes (y no la flanqueada). El producto de esta reacción en cadena será, pues, una molécula lineal de ADN bicatenario constituida por ambas secuencias flanqueantes dispuestas una a continuación de la otra, según el Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas, de página electrónica: www.medtrad.org/panacea.html.

PCR eficaz para amplificar secuencias desconocidas adyacentes a sitios de inserción conocidos en Arabidopsis y aplicable a otros modelos. La reacción comienza con ciclos térmicos de PCR y un par de iniciadores que están relativamente separados. A continuación, se agrega un cebador adicional o un par de cebadores (anidados) que unen la secuencia entre el primer conjunto de cebadores (cebadores externos), con diferentes temperaturas de hibridación. Se agregan en concentraciones más altas que los cebadores externos, de modo que después de unos pocos ciclos de reacción gobiernen y generen más productos de PCR que los otros cebadores. Esta técnica es útil cuando se desea mapear dónde se ha insertado el ADN de transferencia en un genoma.

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

Técnica de análisis de las variaciones en el número de repeticiones de una secuencia sencilla también llamada microsatélite. Se pueden detectar diferencias de tamaño en los productos de PCR entre genotipos distintos, con el uso de iniciadores de PCR para las secuencias que flanquean la repetición.

Sustancia que se emplea para provocar una reacción química o que produce una reacción. En un sentido más amplio, sustancia que, por su capacidad de provocar determinadas reacciones, sirve en los ensayos y análisis químicos, bioquímicos, inmunológicos o serológicos, de hibridación molecular y de amplificación molecular, para revelar la presencia (detectar) o medir la cantidad de otra sustancia o diana (cuantificar), como son enzimas, anticuerpos, sondas, iniciadores, etc.

1. Maquinaria de replicación de ácidos nucleicos. En el caso de la replicación de ADN, está formada por un complejo tripartito que comprende la(s) polimerasa(s) de ADN, la abrazadera deslizante (sliding-clamp) y el cargador de la abrazadera (sliding clamp loader). 2. Algunos autores utilizan este término como sinónimo de ADN polimerasa y, especialmente, de ARN polimerasa; así, podría definirse como enzima polimerasa que cataliza la replicación de macromoléculas como el ADN y ARN. En esta acepción, el término no debe confundirse con el de proteína iniciadora de la replicación (como DnaA o RepA en procariotas, o el complejo proteico ORC en eucariotas), que son proteínas que identifican el origen de replicación y median el ensamblaje de la maquinaria de replicación. 3. Polimerasa de ARN dependiente de ARN, utilizada para la replicación del genoma de virus de ARN. En algunos virus, la replicación del ARN genómico y la síntesis de ARNm se llevan a cabo por la misma enzima, la replicasa; sin embargo, otros virus utilizan una enzima distinta para la síntesis de ARN, la transcriptasa. Por la ambigüedad del término, algunos autores desaconsejan la utilización del nombre replicasa para la designación de las polimerasas de ARN dependientes de ARN.

Aquella que se efectúa de forma automatizada en un secuenciador. La mayoría de los métodos de secuenciación automática utilizados actualmente son modificaciones del método de Sanger. En este método, el ADN que va ser secuenciado funciona como un molde para la síntesis enzimática de un nuevo ADN que comienza en un sitio definido por la unión de un iniciador o cebador. En la reacción se utiliza una mezcla de desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos a unas concentraciones que crean una probabilidad finita de que un didesoxinucleótido se incorpore en lugar del correspondiente desoxinucleótido en cada posición de la cadena que está siendo sintetizada. La incorporación de un didesoxinucleótido bloquea la elongación de la cadena y ello da como resultado una población de fragmentos de ADN truncados de diferente longitud. La identidad del nucleótido que termina la cadena en cada posición se puede determinar: i) realizando cuatro reacciones de elongación separadas, cada una de las cuales con un didesoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP), o ii) con una única reacción de elongación combinando los cuatro didesoxinucleótidos distintos marcados cada uno específicamente. La población de moléculas resultante se separa por tamaños mediante electroforesis en un gel de acrilamida y la secuencia se obtiene correlacionando el orden de los fragmentos en la electroforesis con el didesoxinucleótido que termina cada uno de ellos. Numerosos servicios de secuenciación realizan esta de forma comercial. Una característica de la secuenciación automática que la distingue de la secuenciación manual es la utilización para la extensión de las nuevas cadenas de ADN de una polimerasa termoestable Taq.

Técnica utilizada en la secuenciación automática, en la que rondas sucesivas de desnaturalización, hibridación y extensión en un termociclador específico, dan como resultado una amplificación lineal de los productos de extensión. Estos productos se cargan en un gel o se inyectan en un capilar para la obtención de su secuencia de bases. Las ventajas de la secuenciación cíclica, frente a otras opciones básicamente son: i) sencillez de los protocolos; ii) se requiere menos ADN molde que con los métodos de extensión a una única temperatura; iii) las temperaturas altas reducen considerablemente la estructura secundaria en el ADN así como los sitios secundarios de hibridación del iniciador o cebador; iv) no requiere la etapa de desnaturalización química del ADN de doble cadena; y v) se puede emplear el mismo protocolo para secuenciar ADN de cadena simple, de doble cadena o incluso para la secuenciación directa de amplicones (productos de PCR) de interés.

Aquella empleada para registrar y analizar la asociación entre dos o más variables, habitualmente de naturaleza cualitativa (nominales u ordinales). Frecuentemente en detección y diagnóstico se utilizan las variables infectado (detectado el patógeno) y sano (no detectado el patógeno) y se recoge el resultado obtenido mediante dos técnicas de detección distintas, como ELISA y PCR en tiempo real, o dos técnicas de PCR basadas en distintos iniciadores, al analizar una muestra aleatoria de muestras vegetales. Se puede emplear una tabla de contingencia para expresar la relación entre estas dos variables (infectado y sano) y estimar parámetros de diagnóstico y comparar distintas técnicas. Si se comparan utilizando una técnica de referencia o estándar de oro, puede servir para validar una técnica candidata. Permiten contrastar la independencia o correlación de dos variables mediante una prueba estadística X2 (chi-cuadrado).

ADN simple que al igual que el ARN cebador, es requerido por la ADN polimerasa para la síntesis de ADN.

Pequeña secuencia de ARN, sobre la cual la ADN polimerasa III añade nucleótidos en la replicación del ADN.

Secuencias sintéticas de oligonucleótidos que son utilizadas para reconocer por apareamiento complementario secuencias blanco o diana en ADN molde. Consiste generalmente en ADN genómico. Comúnmente se utilizan un par de cebadores en la reacción de amplificación de la polimerasa (PCR) para definir los extremos del producto que se desea amplificar, y a partir de ellos la ADN polimerasa utilizada inicia la polimerización en dirección 5´-3´. Entre muchas otras aplicaciones también son empleados en reacciones de secuenciación de ADN, donde se utiliza solo un cebador sobre una concentración relativamente alta de ADN blanco, para polimerizar cadenas sencillas de diferente tamaño truncadas por didesoxinucleótidos (método de secuenciación de Sanger) y así determinar las secuencias de bases nitrogenadas.

1. Mezcla de cebadores en los que determinadas posiciones contienen diversas bases, generalmente especificadas por el usuario, produciendo una población de cebadores que cubren todas las posibles combinaciones de nucleótidos en una o más posiciones. Es utilizado con el fin de detectar un gen a partir de secuencias de ADN disponibles de otros organismos estrechamente relacionados. Son aquellos cebadores que tienen similitud y usos específicos cuando se desea amplificar un gen o secuencia de un organismo similar. Un ejemplo de cebador degenerado sería AGTWCT, que comprendería una población de los cebadores AGTACT y AGTTCT. 2. Mezcla de cebadores, y cada uno de los mismos, que muestran variaciones en posiciones concretas de una secuencia común a todos los cebadores.