Diccionario

Secuencias sintéticas de oligonucleótidos que son utilizadas para reconocer por apareamiento complementario secuencias blanco o diana en ADN molde. Consiste generalmente en ADN genómico. Comúnmente se utilizan un par de cebadores en la reacción de amplificación de la polimerasa (PCR) para definir los extremos del producto que se desea amplificar, y a partir de ellos la ADN polimerasa utilizada inicia la polimerización en dirección 5´-3´. Entre muchas otras aplicaciones también son empleados en reacciones de secuenciación de ADN, donde se utiliza solo un cebador sobre una concentración relativamente alta de ADN blanco, para polimerizar cadenas sencillas de diferente tamaño truncadas por didesoxinucleótidos (método de secuenciación de Sanger) y así determinar las secuencias de bases nitrogenadas.

1. Mezcla de cebadores en los que determinadas posiciones contienen diversas bases, generalmente especificadas por el usuario, produciendo una población de cebadores que cubren todas las posibles combinaciones de nucleótidos en una o más posiciones. Es utilizado con el fin de detectar un gen a partir de secuencias de ADN disponibles de otros organismos estrechamente relacionados. Son aquellos cebadores que tienen similitud y usos específicos cuando se desea amplificar un gen o secuencia de un organismo similar. Un ejemplo de cebador degenerado sería AGTWCT, que comprendería una población de los cebadores AGTACT y AGTTCT. 2. Mezcla de cebadores, y cada uno de los mismos, que muestran variaciones en posiciones concretas de una secuencia común a todos los cebadores.

Secuencia de ácido nucleico o de una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Se trata de una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3′-hidroxilo libre, que forma pares de bases con una hebra molde complementaria y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde. Se necesitan dos para la reacción de PCR, uno en el extremo 3′ del fragmento que se quiere amplificar y otro en el extremo 5’ del fragmento. Generalmente se usa un par de cebadores en PCR simple para definir los extremos del producto que se desea amplificar, y a partir de ellos la ADN polimerasa utilizada inicia la polimerización en dirección 5′ – 3′. También son utilizados en secuenciación de ADN, donde se utiliza solo un cebador sobre una concentración relativamente alta de ADN blanco, para polimerizar cadenas sencillas de diferente tamaño truncadas por didesoxinucleótidos (método de secuenciación de Sanger) y así determinar las secuencias de bases nitrogenadas.

Cada una de las secuencias de ADN usada para amplificar ADN en una primera ronda de PCR anidada seguida por una segunda que utiliza cebadores complementarios a la secuencia de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera ronda de PCR (cebadores internos). Los productos de amplificación de la primera PCR constituyen el molde para la segunda amplificación.

Cada una de las secuencias de ADN complementarias a una secuencia de ADN ya amplificada por PCR anidada en una primera ronda de amplificación con el uso de cebadores externos o aquel cebador único utilizado en la segunda ronda de una PCR semianidada.

Aquel que sintetizará la cadena complementaria del ADN diana. En la reacción de PCR es uno de la pareja de cebadores utilizados junto a los cebadores hacia delante.

Enzima con actividad ARN polimerasa, que sintetiza fragmentos cortos de ARN (5-10 nt) complementarios de la cadena de ADN molde, para permitir la síntesis de ADN en la cadena retrasada durante la replicación. Es una enzima propia de los virus de ARN que cataliza la replicación del ARN a partir de una plantilla de ARN. Específicamente, cataliza la síntesis de la hebra de ARN complementaria a una plantilla de ARN determinada.

1. Mezcla de cebadores de composición nucleotídica similar. Cada cebador de la mezcla es un oligonucleótido compuesto de un número idéntico de nucleótidos y tiene una secuencia nucleotídica básica en común con el resto de los componentes de la misma, pero difiere en ciertas posiciones (conocidas en inglés como variable, degenerate o redundant positions). Tal mezcla es necesaria para amplificar una región genómica específica, cuya secuencia nucleotídica se ha deducido a partir de la secuencia de aminoácidos conocida de la proteína, pues un mismo aminoácido puede estar codificado por más de un triplete o codón (como es el caso de la fenilalanina y la tirosina que disponen de dos codones sinónimos, y de la isoleucina que dispone de tres, como ejemplos). 2. Por extensión, cualquiera de los cebadores individuales que componen la mezcla anterior.

ADN simple que al igual que el ARN cebador, es requerido por la ADN polimerasa para la síntesis de ADN.

Pequeña secuencia de ARN, sobre la cual la ADN polimerasa III añade nucleótidos en la replicación del ADN.

Cebador utilizado en secuenciación masiva, que se une a los extremos 5´ y 3´ de cada fragmento de ADN en una genoteca de secuenciación. Actúa en la amplificación y secuenciación del ácido nucleico adyacente.

Aquella que utiliza cebadores de PCR cortos (alrededor de 10 bases) con secuencias arbitrarias y a bajas temperaturas de apareamiento. Hay descritos gran número de cebadores disponibles y es fácil de realizar, pero tiene ciertas limitaciones de reproducibilidad.

Técnica prácticamente universal para generar patrones de amplificación de DNA para el tipado e identificación de diversas especies de bacterias. Están disponibles protocolos generales descritos por EPPO (2010 y 2014). Se realiza mediante la técnica denominada rep-PCR que se basa en la amplificación de secuencias repetitivas, específicas y conservadas, presentes en múltiples copias en los genomas de la mayoría de las bacterias gramnegativas y positivas, como las secuencias extragénicas palindrómicas repetitivas (REP), las secuencias intergénicas consenso y repetidas de enterobacterias (ERIC), las secuencias repetitivas y conservadas de las subunidades BOX A de los elementos BOX de Streptococcus pneumoniae, etc., con la finalidad de identificar bacterias muy distintas. En la mayoría de los casos, la utilización de estos cebadores da lugar a patrones de amplificación a pesar de que los organismos diana no contengan las repeticiones correspondientes (ERIC, BOX, etc.), por lo que en general se considera que es una PCR arbitraria.

Técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que no precisa de ciclos de temperaturas para la desnaturalización de las hebras de ADN, ya que, debido a la acción de enzimas de restricción que generan mellas en el ADN, este proceso se realiza de forma enzimática. Es una modificación de la PCR o RT-PCR simple convencional que mejora su rendimiento final. Se basa en la capacidad de una ADN polimerasa modificada, para desplazar una hebra monocatenaria resultante de un corte en una región específica y a partir de esta hebra desplazada, iniciar la replicación o amplificación de ese ADN diana. Con este procedimiento, las hebras desplazadas sirven como molde para los nuevos ciclos de amplificación, generando por un lado que los productos de amplificación se multipliquen por más del doble al final de cada ciclo de amplificación y por otro, que se observe un incremento en la velocidad de reacción, sensibilidad y especificidad de la técnica respecto a la PCR o RT-PCR simple convencional. Se puede llevar a cabo la replicación, amplificación o la secuenciación de un ADN mediante una ADN polimerasa del tipo fago φ29 o 29 (Phi29). Se realiza en un único tubo, lo que contribuye a evitar contaminaciones, en plataformas convencionales de la PCR cuantitativa, con un mayor número y concentración de cebadores. Incrementa la eficiencia y sensibilidad de la PCR, y se efectúa aumentando la velocidad final de la reacción.

Amplificación molecular de ácidos nucleicos que se realiza a temperatura constante, no precisando de un termociclador como en la PCR convencional, ya que permite la amplificación sin la necesidad de ciclos repetidos de desnaturalización e hibridación a diferentes temperaturas. Las diferentes técnicas de amplificación isotérmica se han popularizado para detectar un amplio espectro de dianas o blancos que incluyen no solo ADN y ARN, sino también proteínas, células, pequeñas moléculas e iones. Se utiliza como principio de funcionamiento en biosensores y en variados métodos de detección, diagnóstico e identificación. La amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), la de círculo rodante (RCA), la mediada por bucle o asa (LAMP) y NASBA son algunos ejemplos de técnicas de amplificación de ADN o ARN (RT-LAMP) que utilizan como principio la amplificación isotérmica. Aunque estas técnicas se basan principalmente en la replicación del ADN, la mayoría de estos métodos amplifican ácidos nucleicos utilizando cebadores diseñados con estrategias diferentes a las empleadas en la PCR. Además, pueden alcanzar una amplificación exponencial utilizando únicamente una ADN polimerasa (como el caso de LAMP) aunque algunas otras requieren enzimas o proteínas adicionales. Su desarrollo al margen de los circuitos comerciales interesados en explotar reactivos de PCR y sus termocicladores automáticos asociados, ha limitado su aplicación a pesar de su interés.

Método que emplea la ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 y cebadores al azar para la amplificación de moléculas de ADN. Constituye una alternativa eficaz y rápida para la detección de virus de genoma monopartito de ADN circular de cadena sencilla, incluyendo posibles nuevas variantes, al tratarse de una técnica que no precisa del conocimiento previo de la secuencia viral. Se han propuesto protocolos estandarizados EPPO para diagnóstico y detección de Begomovirus (familia Geminiviridae), que incluyen un análisis serológico inicial y una PCR para confirmar la infección.

Técnica de amplificación molecular isotérmica muy sensible, específica y selectiva, que se basa en la utilización de tres proteínas: una recombinasa, una proteína de unión a ADN monocatenario (proteína SSB, o single-stranded DNA-binding protein) y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra (strand displacement). La recombinasa forma un complejo nucleoproteico con el cebador en presencia de ATP y de un agente concentrador, como polietilenglicol; este complejo se une a la secuencia de ADN homóloga al cebador y favorece la desnaturalización local del ADN. Las regiones de cadena única se estabilizan mediante unión de la proteína SSB y, al disociarse la recombinasa del ADN, la ADN polimerasa se une al extremo 3’ del cebador e inicia la síntesis de ADN en presencia de dNTPs. La repetición cíclica de este proceso da lugar a una amplificación exponencial del ADN a una temperatura de 37–42 °C, sin requerir ciclos térmicos como la PCR. La técnica es robusta, pues puede amplificar con una preparación mínima de la muestra y permite utilizar extractos crudos, brutos o muy poco procesados. Permite producir una cantidad detectable de ADN amplificado en unos 20 minutos y partiendo de 1–10 copias del ADN diana. Se ha utilizado para amplificar ARN, ARNmi, ADN monocatenario (ssDNA) y ADN bicatenario (dsDNA) de una amplia variedad de organismos y muy distintas muestras. Se utiliza en detección de agentes fitopatógenos, genómica y biotecnología. Esta técnica, para detección del oomiceto Phytophthora pini, se ha combinado con un sistema de detección visual mediante un dispositivo de flujo lateral, lo que permite identificar la presencia del patógeno de forma sencilla. Combinado con CRISPR-Cas12a, conocida por su capacidad de edición genética y detección de secuencias específicas de ADN, permite la detección precisa, con alta sensibilidad, de secuencias diana.

Aquella utilizada en secuenciación masiva que consiste en la generación de copias in situ de una molécula específica de ADN en un soporte sólido cubierto de cebadores.

El enzima primasa hace un iniciador de ARN, un corto segmento de ácido nucleico complementario al molde, que proporciona un extremo 3′ con el que la ADN polimerasa puede trabajar. Un cebador típico es de cinco a diez nucleótidos de largo. El cebador o iniciador ceba la ADN polimerasa, es decir, le proporciona lo que necesita para funcionar. Una vez que el cebador de ARN está en su sitio, la ADN polimerasa lo extiende, añadiendo nucleótidos uno a uno para hacer una cadena nueva de ADN complementaria a la cadena molde.

Técnica de identificación e investigación molecular de especies que consiste en la utilización de una sección corta de ADN de una región estandarizada del genoma (pequeña región de un gen, que ha sido elegida por consenso), para la identificación de animales, plantas o microorganismos. Está basada en la secuenciación de regiones cortas altamente variables del genoma y que aparecen en un elevado número de copias por célula. Una vez que se ha obtenido la secuencia de código de barras de ADN, se la coloca en la base de datos del sistema de código de barras de la vida Se utilizan estas secuencias para la identificación de especies. Con el fin de facilitar la amplificación, el código de barras de ADN debería presentar regiones de unión a cebadores muy conservadas, flanqueando la región génica elegida, de modo que podría utilizarse la misma pareja de cebadores en una amplia gama de microorganismos, y funcionarían como cebadores universales. Además, los marcadores genéticos son más fáciles de amplificar si se presentan en múltiples copias. Por otro lado, si los códigos de barras genéticos son fáciles de alinear facilitan la identificación de especies basada en árboles filogenéticos o bases de datos relacionados, que es el sistema generalmente utilizado para identificar especies por este método. Es aconsejable la cautela respecto de la fidelidad de las bases de datos a efectos de comparación de secuencias con fines de identificación; por ejemplo, recientemente se ha cuestionado la validez del código de barras del ADN basado en una sola secuencia génica, como la región intergénica del ARN ribosómico (ITS), y se ha recomendado que la delimitación de especies fúngicas se base en más de un locus (multilocus), que presumiblemente sean evolutivamente neutrales. La generación de marcadores moleculares, como el código de barras de ADN que sean específicos de especie, subespecie, raza, patovar, etc., y en el genotipado de estos, facilitarán: i) la identificación y evaluación de la distribución espacio-temporal de las variantes de cada agente nocivo, que son clave para el despliegue de las resistencias; ii) el análisis del potencial evolutivo de los agentes nocivos a través de la estructura genética de sus poblaciones, que es determinante para la estabilidad de las resistencias; e incluso; iii) la determinación del posible origen geográfico de un agente nocivo tras una introducción accidental, ilegal o voluntaria en una nueva zona. El código de barras del ADN microbiano se utiliza para caracterizar una mezcla de microorganismos, por ejemplo obtenidos sin clasificar en el medio ambiente, a partir de «marcadores genéticos universales» para identificar el ADN de muchas especies, incluso dentro de una mezcla de distintos microorganismos.

Cualquiera de los fragmentos de ADN (1-2 kb en procariotas; 0,1-0,2 kb en eucariotas) que tiene en su comienzo un ARN cebador y que se forma durante la replicación discontinua de la cadena retrasada del ADN.

Sigla del inglés. Amplificación isotérmica mediada por bucle o asa, que utiliza una única temperatura para amplificar ácidos nucleicos y, por tanto, no requiere el uso de termocicladores ya que se puede realizar en baño termostático y la amplificación puede observarse visualmente mediante colorimetría, fluorescencia, etc. Está basada en el uso de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y cuatro cebadores específicos. El método se ha adaptado a la amplificación de ARN (RT-LAMP). Su utilización se está incrementando en el diagnóstico de muestras que requieren sencillez y rapidez, bajo coste económico y la posibilidad de su uso in situ en campo, mediante equipos portátiles. Sin embargo, en muchos casos no se suele conseguir el mismo nivel de sensibilidad analítica que con PCR o RT-PCR en tiempo real.

1. Parte del producto que se pierde, deteriora o estropea. 2. Parte intencionadamente no añadida de cierta cantidad de productos químicos o reactivos que le corresponden a la receta de un tampón o de anticuerpos a una solución, o de cebadores a una mezcla maestra, con finalidad de ahorro.

Código de barras de ADN/ARN que permite la identificación simultánea de muchos taxones dentro de la misma muestra. La principal diferencia entre el código de barras y el metacódigo de barras es que este último no se enfoca en un organismo específico, sino que tiene como objetivo determinar la composición de especies dentro de una muestra. Un código de barras consta de una región genética variable corta que es útil para la asignación taxonómica flanqueada por regiones genéticas altamente conservadas que se pueden usar para el diseño de cebadores. El procedimiento de codificación de metabarras, como la codificación de barras general, procede en orden a través de las etapas de extracción de ADN, amplificación por PCR, secuenciación y análisis de datos. Se utilizan diferentes genes dependiendo de si el objetivo es codificar en barras una sola especie o metabarcodificar varias especies. En este último caso, se utiliza un gen conservado y de amplia distribución (“universal”). La metabarcodificación no utiliza ADN/ARN de una sola especie como punto de partida, sino de varios organismos diferentes derivados de una muestra ambiental o a granel. Tiene aplicaciones obvias para el monitoreo de la diversidad en todos los hábitats y grupos taxonómicos, la reconstrucción de ecosistemas antiguos, la detección de especies invasoras, las respuestas a la contaminación y el monitoreo de la calidad del aire. Se trata de un método único que aún está en desarrollo y probablemente seguirá evolucionando durante algún tiempo a medida que la tecnología avance y los procedimientos se estandaricen. Este sistema supera el inconveniente del uso, para identificación, de especies previamente secuenciadas.

Secuencia de bases de los ácidos nucleicos utilizados para la síntesis de cadenas de ADN o ARN complementarias. En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), si la hebra de ADN sintetizada posee una secuencia cebadora en un extremo y una secuencia complementaria para un segundo cebador en el otro, se habla de molde corto y si la hebra se extiende más allá del sitio complementario del segundo cebador, se habla de molde largo.

Técnica utilizada para generar mutaciones puntuales, inserciones o deleciones en una cadena de ADN. La generación de mutaciones puntuales requiere sintetizar un fragmento corto de ADN, el cebador, que contenga la mutación. El cebador debe hibridar con la molécula simple, unicatenaria, de ADN que contenga el gen de interés. Mediante una ADN polimerasa, se elonga la cadena (el fragmento unicatenario más el cebador) incorporando la mutación al ADN y formando una molécula de ADN completa bicatenaria. Dicha doble cadena de ADN puede ser introducida en una célula huésped y clonarla, tras lo que se pueden escoger los mutantes de interés. Para la generación de inserciones y deleciones, a menudo se utilizan fragmentos de DNA clonado que se intercambian con el genoma mediante un proceso de intercambio de marcadores (marker-exchange) o que simplemente se integran (Campbell integration), generando la mutación. Existen muchas otras metodologías para la generación de mutaciones dirigidas, tanto en procariotas como en eucariotas; un ejemplo de mutagénesis dirigida en eucariotas de amplia utilización es la tecnología CRISPR-Cas.

Compuesto que consta de una base nitrogenada, un azúcar pentosa y ácido fosfórico. Constituyen las unidades estructurales básicas (monómeros) a partir de las cuales se construyen los polímeros ADN y ARN. Los principales nucleótidos presentes en las células vivas son los que provienen de las purinas adenina y guanina y de las pirimidinas citosina, timina y uracilo. El azúcar es la D-desoxirribosa (en el ADN) o la D-ribosa (en el ARN). Los nucleótidos se encuentran también en la célula como mononucleótidos o dinucleótidos libres: adenina, G para guanina, T para timina, C para citosina, la segunda letra mayúscula indica el número de fosfatos (mono, di, tri) y la tercera letra es siempre P, que significa fosfato. Así dATP, significa desoxirribosa adenosina trifosfato. Los NTP son los componentes básicos del ARN y los dNTP son los componentes básicos del ADN. Se utilizan para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), síntesis de ADNc, síntesis y marcaje de cebadores y de ADN, transcripción in vitro, amplificación isotérmica, clonación, secuenciación de Sanger y secuenciación de próxima generación (NGS), entre otras aplicaciones. Se pueden elegir comercialmente productos individuales (dATP, dGTP, dTTP, dCTP y dUTP) o como una mezcla de las cuatro especies.

Proceso que radica en el ajuste de las condiciones de amplificación (temperaturas y tiempos de desnaturalización, hibridación de cebadores o iniciadores y extensión y en el número de ciclos) junto a las concentraciones y los componentes de la reacción, con el fin de obtener patrones nítidos y reproducibles de los productos de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) en distintos termocicladores.

Sigla del inglés. En español, reacción en cadena de la polimerasa. Se sugiere el uso de la sigla PCR en español, en vez de RCP que le correspondería, para evitar la confusión con el uso extendido de la sigla del término “reanimación cardiopulmonar”. Se trata de una técnica de amplificación molecular desarrollada para producir múltiples copias sintéticas de una secuencia de ADN, o diana, al realizar varios ciclos sucesivos, de tres etapas secuenciales: i) desnaturalización del ADN diana a >90 °C; ii) hibridación de los cebadores o iniciadores a 40-65 °C; y iii) extensión a 72 °C. En cada ciclo se consigue, en poco tiempo, duplicar el número de copias de ADN de modo que se logra un aumento exponencial del número de copias del fragmento o amplicón. En la denominada PCR convencional, los fragmentos amplificados se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan mediante métodos colorimétricos o basados en tinción con bromuro de etidio, GelRed u otros fluorocromos. También se pueden detectar los amplicones mediante hibridación en membrana, ELISA en microplaca y otros métodos, y su tamaño se calcula por comparación con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Es utilizada frecuentemente para detectar e identificar organismos fitopatógenos, basada en la amplificación de un fragmento del material genético del patógeno. Se utiliza una pareja de iniciadores, o más, y su eficiencia se basa en la especificidad de los cebadores, tipo de polimerasa empleada, composición y estabilidad del tampón, pureza y concentración de la mezcla de nucleósidos trifosfatos (dNTPs), parámetros de la amplificación (temperatura de hibridación de los cebadores, concentración de MgCl2, etc.), así como en las características de la propia muestra. Su mayor inconveniente para la detección y diagnóstico reside en el alto riesgo de contaminaciones por aerosoles que se generan fácilmente en las distintas etapas, especialmente en la preparación de la electroforesis y que dan lugar a falsos resultados positivos, como coste de su alta sensibilidad analítica. Posee diversas variantes, entre otras: PCR anidada, PCR semianidada, PCR cooperativa, PCR asimétrica, inmunocaptura-PCR, impresión captura-PCR, escachado captura-PCR, PCR dúplex y múltiple, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR digital, PCR capilar y otras menos comunes. La PCR es teóricamente un método de detección muy sensible. Sin embargo, en la práctica y aplicado a material vegetal, artrópodos, o especialmente ciertos tipos de suelo, la sensibilidad se reduce drásticamente por la presencia de inhibidores, que pueden dar lugar a falsos negativos. Para superar estos inconvenientes es imprescindible incluir un control positivo y varios controles negativos en el conjunto de las muestras. Asimismo, se emplean métodos de purificación de ácidos nucleicos y otras variantes más sensibles basadas en PCR anidada o PCR en tiempo real, alguna de las cuales pueden realizarse con métodos directos de preparación de la muestra. Para la amplificación a partir de ARN (PCR de ARN) debe realizarse una etapa previa de transcripción reversa (RT).

Técnica de PCR que permite la amplificación de ADN o ARN cuando solo se conoce el extremo 3′ de la secuencia de interés. Por ejemplo, el extremo 5′ de la región a amplificar es artificialmente creado añadiendo una cola de nucleótidos definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un cebador 5′. A partir de aquí se realiza una PCR simple convencional. También puede efectuarse la versión RT-PCR anclada.

Variante de la PCR convencional simple que comprende dos rondas de amplificación consecutivas, con distintos pares de cebadores (externos e internos a la secuencia diana), con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el fragmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica. Se efectúa consecutivamente en dos tubos distintos, implicando dicha operación serios riesgos de contaminación, pues supone abrir el tubo con los amplicones de la primera ronda para realizar la segunda ronda de amplificación. Para solventar el problema se han diseñado protocolos en un solo tubo cerrado. La PCR anidada supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de la PCR o RT-PCR convencional.

Procedimiento para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR o RT-PCR anidada o la semianidada en dos rondas consecutivas de amplificación en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación por aerosoles al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. Para solventar este problema, se desarrolló un sistema para la separación física de los cebadores externos e internos dentro de un mismo tubo, mediante el uso de la parte final de una punta de pipeta de 100 L en cuyo interior se deposita el segundo cóctel y donde se mantiene por capilaridad. Esta estrategia permite realizar las dos amplificaciones sin abrir o cambiar de tubo. Transcurrida la primera amplificación, es suficiente agitar levemente el tubo para que el segundo cóctel se mezcle con el resultado de la primera amplificación y, sin abrir el tubo, comience la segunda amplificación. La PCR anidada en un solo tubo cerrado supone un aumento de 100 a 1.000 veces en la sensibilidad de PCR o RT-PCR convencional y es interesante cuando no se dispone de otras opciones como PCR en tiempo real. También puede efectuarse la versión RT-PCR en un solo tubo cerrado.

Método de PCR basado en la acción simultánea y coordinada de cuatro cebadores, que permite la detección de bacterias y virus de ARN, viroides y otros ARN transcritos, en su variante de RT-PCR. La reacción tiene lugar en un único cóctel y en un solo tubo cerrado. En el caso de RT-PCR, la transcripción reversa y simultánea de los fragmentos, la coordinación entre cebadores externos e internos y la cooperación de los amplicones a modo de cebadores o iniciadores son la base del método. Su sensibilidad es similar a la del PCR y RT-PCR anidada, que resulta ser 100 veces mayor que la obtenida con PCR o RT-PCR simples y utiliza 10 veces menos reactivos. Es una opción económica si no se dispone de termociclador para PCR en tiempo real. También puede realizarse la versión RT-PCR cooperativa.

Método de PCR para evitar que los cebadores amplifiquen secuencias no específicas. El procedimiento se basa en que la especificidad de los productos de la reacción depende de la temperatura de hibridación a la que se produce la misma. Cuanto menor es la temperatura, menor es la especificidad. Además, se basa en que la temperatura de fusión del ADN (Tm) de los iniciadores establece un límite superior a la temperatura de hibridación. Al mantener inicialmente la temperatura muy cerca de la temperatura de fusión de los cebadores, los productos más específicos se amplificarán primero y, por lo tanto, no serán absorbidos por los productos no específicos a medida que se reduce la temperatura de la reacción. Además, la amplificación inicial hace que haya más dianas de la secuencia específica disponible para la amplificación, lo que también ayuda a superar a los productos no específicos. Puede efectuarse en la versión RT-PCR de toma de contacto.

Variante que se diferencia de una PCR simple o convencional estándar en que utiliza un conjunto de cebadores con secuencias degeneradas en vez de un solo par de cebadores de secuencia única. Permite amplificar genes nuevos y familias multigénicas. Constituye una herramienta clave en estudios evolutivos a nivel molecular. Se basa en el diseño de un cebador degenerado con el fin de detectar o encontrar un gen a partir de secuencias de ADN disponibles de otros organismos estrechamente relacionados. También es muy frecuente la versión RT-PCR degenerada.

Variante de la técnica de PCR simple convencional donde se emplean dos pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente dos segmentos distintos de ADN. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de dos aislados o cepas del mismo patógeno o de dos patógenos diferentes, incluso si son de ADN y ARN. También es frecuente la PCR múltiple y la versión RT-PCR dúplex.

Variante de la técnica de PCR simple convencional en la que se emplean dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Permite detectar ADN de dos o más patógenos en la misma muestra. Requiere la selección de cebadores específicos y compatibles para las distintas regiones diana. Resulta útil ya que son frecuentes las infecciones mixtas de distintos aislados o cepas del mismo patógeno o combinaciones de estos con otros patógenos diferentes, incluso de ADN y ARN simultáneamente, siendo muy frecuente la versión RT-PCR múltiple.

La PCR o RT-PCR semianidada utiliza dos cebadores externos y un único cebador interno. Este procedimiento permite aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR simple convencional. Generalmente, las amplificaciones se realizan en tubos separados, con el consiguiente alto riesgo de contaminación al transferir de uno a otro el producto de la primera amplificación. La versión RT-PCR semianidada es muy utilizada.

PCR eficaz para amplificar secuencias desconocidas adyacentes a sitios de inserción conocidos en Arabidopsis y aplicable a otros modelos. La reacción comienza con ciclos térmicos de PCR y un par de iniciadores que están relativamente separados. A continuación, se agrega un cebador adicional o un par de cebadores (anidados) que unen la secuencia entre el primer conjunto de cebadores (cebadores externos), con diferentes temperaturas de hibridación. Se agregan en concentraciones más altas que los cebadores externos, de modo que después de unos pocos ciclos de reacción gobiernen y generen más productos de PCR que los otros cebadores. Esta técnica es útil cuando se desea mapear dónde se ha insertado el ADN de transferencia en un genoma.

Cada una de las proteínas bacterianas que se unen a las hebras de ADN monocatenario, por ejemplo, las recientemente separadas por la helicasa durante la replicación del ADN, las generadas durante la recombinación o las resultantes de un daño. Se colocan una detrás de otra a lo largo de la hebra separada y forman una cubierta proteica que mantiene el ADN en el estado de elongación necesario para que pueda servir de plantilla durante la síntesis de ADN y de los ARN cebadores. En eucariotas, la principal proteína de unión a DNA monocatenario es un complejo de tres subunidades y se denomina proteína de replicación A (replication protein A, RPA).

Acrónimo del inglés. En español, amplificación aleatoria de ADN polimórfico. Técnica que consiste en la amplificación aleatoria por PCR de segmentos de ADN mediante el uso de cebadores pequeños (generalmente de 10 nucleótidos de longitud) de secuencias aleatorias no palindrómicas, con un contenido de G+C entre 50 y 80 %. Se trata de marcadores que amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Se basan en la probabilidad estadística de que los cebadores arbitrarios que se unen a los sitios no específicos del ADN lo amplifiquen, ya que se presentan sitios complementarios al oligonucleótido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma. Los fragmentos amplificados migrarán en un gel de agarosa y se podrán observar las diferencias en el patrón de bandas.

Aquella que tiene lugar entre un reactivo (anticuerpo, sonda, cebador, sustrato, etc.) y una diana distinta de la pretendida, pero similar a la que sirvió para diseñar o producir el reactivo supuestamente específico. También se denomina reactividad cruzada. En la naturaleza todo es limitado, por lo tanto, pueden coincidir por simple casualidad, además de por parentesco, secuencias, proteínas, dianas, epítopos, etc. de un patógeno con las de otro o con las de su huésped o anfitrión, otras plantas, su vector u otros. Así, un antígeno de un agente patógeno puede ser reconocido por anticuerpos desarrollados contra otro patógeno, o coincidir en toda o una gran parte de la secuencia empleada para diseñar una sonda o un cebador, con la secuencia de otro agente patógeno o incluso del huésped o de otro organismo. Las reacciones cruzadas son específicas, aunque generalmente indeseadas, salvo en casos en los que se desee establecer y valorar el parentesco inmunológico, bioquímico o de secuencias, entre distintas dianas.

Producto químico, tampón, enzima, anticuerpos, sonda, cebadores, etc., usados para el diagnóstico, detección o identificación de agentes fitopatógenos o como componente de un kit de diagnóstico.

Aquella que se efectúa de forma automatizada en un secuenciador. La mayoría de los métodos de secuenciación automática utilizados actualmente son modificaciones del método de Sanger. En este método, el ADN que va ser secuenciado funciona como un molde para la síntesis enzimática de un nuevo ADN que comienza en un sitio definido por la unión de un iniciador o cebador. En la reacción se utiliza una mezcla de desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos a unas concentraciones que crean una probabilidad finita de que un didesoxinucleótido se incorpore en lugar del correspondiente desoxinucleótido en cada posición de la cadena que está siendo sintetizada. La incorporación de un didesoxinucleótido bloquea la elongación de la cadena y ello da como resultado una población de fragmentos de ADN truncados de diferente longitud. La identidad del nucleótido que termina la cadena en cada posición se puede determinar: i) realizando cuatro reacciones de elongación separadas, cada una de las cuales con un didesoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP), o ii) con una única reacción de elongación combinando los cuatro didesoxinucleótidos distintos marcados cada uno específicamente. La población de moléculas resultante se separa por tamaños mediante electroforesis en un gel de acrilamida y la secuencia se obtiene correlacionando el orden de los fragmentos en la electroforesis con el didesoxinucleótido que termina cada uno de ellos. Numerosos servicios de secuenciación realizan esta de forma comercial. Una característica de la secuenciación automática que la distingue de la secuenciación manual es la utilización para la extensión de las nuevas cadenas de ADN de una polimerasa termoestable Taq.

Técnica utilizada en la secuenciación automática, en la que rondas sucesivas de desnaturalización, hibridación y extensión en un termociclador específico, dan como resultado una amplificación lineal de los productos de extensión. Estos productos se cargan en un gel o se inyectan en un capilar para la obtención de su secuencia de bases. Las ventajas de la secuenciación cíclica, frente a otras opciones básicamente son: i) sencillez de los protocolos; ii) se requiere menos ADN molde que con los métodos de extensión a una única temperatura; iii) las temperaturas altas reducen considerablemente la estructura secundaria en el ADN así como los sitios secundarios de hibridación del iniciador o cebador; iv) no requiere la etapa de desnaturalización química del ADN de doble cadena; y v) se puede emplear el mismo protocolo para secuenciar ADN de cadena simple, de doble cadena o incluso para la secuenciación directa de amplicones (productos de PCR) de interés.

1. Región o zona de un patógeno o sus metabolitos, elegida para producir o diseñar herramientas o reactivos apropiados para su diagnóstico universal (sitios conservados) o específico o para su inactivación efectiva por medio de pesticidas o agentes de biocontrol. 2. Región de la secuencia que se utiliza en el diseño de sondas o cebadores, ya sea por su especificidad o por representar una secuencia conservada y, por tanto, apta para un diagnóstico universal. 3. Epítopo o determinante antigénico elegido para diagnóstico selectivo o universal, por medio de anticuerpos, generalmente monoclonales o recombinantes producidos frente al mismo, ya sea natural (purificado) o sintético (generalmente péptidos).

Aquel que puede ser utilizado para secuenciación automática de ADN, como: i) vector de clonación: ya sea de cadena simple (generalmente del bacteriófago M13) o de doble cadena (los más frecuentemente utilizados), y que pueden ser un vector plasmídico, un fagémido (vectores híbridos, plásmidos de doble cadena que contienen un origen de replicación de un bacteriófago de cadena simple), o cósmidos (que contienen el fragmento cos del fago lambda y son capaces de replicar fragmentos grandes de ADN) o; ii) fragmentos de PCR, ya sean productos de PCR de cadena sencilla, con exceso de un cebador, o productos de PCR de doble cadena, con cantidades idénticas de cada cebador.

Proceso que implica la generación de una cadena de ácido desoxirribonucleico doble cadena complementario (ADNc) a partir de ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple. La primera hebra de ADNc obtenida es la cadena complementaria de la cadena molde de ARN, y a partir de ella se sintetiza la segunda hebra de ADN para obtener una molécula bicatenaria. Como los viroides y la gran mayoría de los virus de plantas poseen genoma de ARN, la transcripción reversa se ha convertido en la técnica de referencia para la detección de ARN de patógenos mediante RT-PCR. El ARN es convertido o retrotranscrito a ADNc mediante el uso de cebadores de PCR y la acción de la enzima transcriptasa reversa.

Sigla del inglés. En español, número variable de repeticiones en tándem Las repeticiones en tándem son secuencias cortas de ADN altamente variables y repetidas un número variable de veces en el genoma bacteriano. Tienen de 21 a 47 pb y están separadas por fragmentos de secuencias no repetidas del mismo tamaño. Son altamente inestables, pudiendo presentar variabilidad en el número de unidades de cada repetición, designándose su análisis como VNTR y debido a su polimorfismo, se han utilizado como marcadores para la tipificación de especies bacterianas, pero también de otros tipos de organismos, incluyendo virus y hongos. La utilización de cebadores de PCR que delimiten la región de repetición permite visualizar el polimorfismo en el número de unidades repetidas mediante electroforesis, calculando el número de repeticiones según el tamaño de las secuencias amplificadas.