Diccionario

Denominación común en español, que proviene del acrónimo del inglés “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, o ensayo inmunoenzimático en fase sólida o ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, popularmente ELISA. Da nombre a una técnica inmunológica o ensayo inmunoenzimático o serológico muy sensible para detectar, cuantificar, identificar o comparar antígenos complejos (agentes patógenos), proteínas, anticuerpos, péptidos u hormonas, incluso en extractos vegetales brutos. Esta prueba se caracteriza por utilizar un soporte insoluble o inmunoadsorbente (microplacas, tubos, pocillos o membranas) para fijar, tapizar o sensibilizar con antígenos o anticuerpos, según la modalidad de técnica. La prueba consiste en una serie de incubaciones mediadas por lavados, hasta adicionar el substrato. Se caracteriza porque la reacción se revela con anticuerpos conjugados enzimáticamente (frecuentemente en Patología vegetal con fosfatasa alcalina de mucosa intestinal de ternera y en ocasiones con peroxidasa de rábano picante) o biotinilados y un sustrato apropiado a la enzima marcadora (p-nitrofenil fosfato en el caso de la fosfatasa alcalina y peróxido de hidrógeno para la peroxidasa). La densidad óptica o valor ELISA final es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo detectado y permite asignar un valor numérico a la detección semicuantitativa. Se han diseñado distintas variantes o modalidades: ELISA directo, indirecto, de doble sándwich de anticuerpos (DAS), indirecto doble sándwich de anticuerpos (DASI), y competición. Las modalidades pueden realizarse con anticuerpos policlonales, con anticuerpos monoclonales, con anticuerpos recombinantes o con fragmentos F(ab´)2 de anticuerpo y proteína A conjugada. La técnica ELISA puede realizarse con sustratos solubles o precipitantes.

Variante de ELISA con anticuerpos conjugados con biotina y revelado de la reacción con estreptavidina (actualmente más utilizada que la avidina). La estreptavidina conjugada con una enzima, presenta muchas ventajas ya que la constante de afinidad del complejo biotina-estreptavidina es una de las más altas conocidas. Además, las proteínas delatoras o conjugados con biotina son sencillos de preparar, estables, económicos y muy polivalentes, pues el mismo anticuerpo sirve para revelar con estreptavidina marcada con distintas enzimas (habitualmente fosfatasa alcalina o peroxidasa) u otros compuestos.

Variante de ELISA usada en comparación de antígenos (como agentes patógenos) para establecer mapas epitópicos o parentescos serológicos, que está basada en la competición de dos antígenos por un sitio común de reacción de un anticuerpo. Se realiza mediante dos reacciones en paralelo. En una reacción en una placa tapizada con anticuerpos, se añaden antígenos conjugados, homólogos de los anticuerpos, y se valora su densidad óptica final. En la reacción en paralelo, a una placa similar se añade el antígeno homólogo usado en la reacción primera (en concentración conocida) en mezcla con el antígeno distinto que se desee comparar y se valora la densidad óptica de esta segunda reacción. Al comparar los valores ELISA finales de ambas reacciones se puede cuantificar la competición, si esta existiera, por los sitios de unión de los anticuerpos utilizados. A mayor similitud entre ambos antígenos, más competición y menor valor ELISA.

Inmunoensayo que se produce en la superficie de una cámara de reacción representada por un canal de microfluidos. La fuerza capilar dentro del microcanal atrae a los reactivos en la cámara de reacción y también facilita la incubación del ensayo. Una almohadilla subyacente absorbe automáticamente el exceso de líquido, siendo la única operación requerida la carga secuencial de tampones y reactivos. El volumen de muestra es de 10 L y el uso de reactivos es de 5 a 10 veces menor comparado con una técnica ELISA convencional. Se ha aplicado a varios virus de plantas.

Variante de ELISA para valorar anticuerpos conjugados o para detectar antígenos. Sobre una microplaca (o un inmunoadsorbente) tapizada con antígeno, se añaden los anticuerpos específicos del antígeno, marcados con una enzima o biotinilados y se incuban. En la etapa final, tras añadir el sustrato se obtendrá un valor ELISA (densidad óptica) proporcional a la cantidad de enzima fijada, que sugerirá la dosis de conjugado a emplear, caso de que el mismo sea válido o se observará si ha existido reacción con la muestra tapizada en la que se deseaba detectar un patógeno concreto. Esta técnica está en desuso para la detección de antígenos (agentes patógenos) pues exige la preparación de conjugados para cada antígeno a detectar, problemática resuelta por ELISA indirecto.

Variante de ELISA DAS (doble sándwich de anticuerpos) combinada con el sistema de revelado de ELISA indirecto. Se realizan los mismos pasos, pero requiere producir anticuerpos específicos en dos especies animales distintas. Se evita realizar conjugados al revelar la reacción con anticuerpos específicos (como los empleados en la fase primera de tapizado) y tras incubación y lavado se añaden inmunoglobulinas anti la especie animal utilizada para generar los anticuerpos específicos frente al patógeno de interés, pero conjugados, con una enzima. Se suele utilizar con anticuerpos policlonales de conejo en la fase de tapizado y anticuerpos monoclonales específicos de ratón, y revelar con inmunoglobulinas de cabra antirratón conjugadas con una enzima (normalmente fosfatasa alcalina). La modalidad es muy sensible (capaz de detectar del orden de 0,05-0,1 g de antígeno), pues permite amplificar la reacción con la adición de inmunoglobulinas anti especie marcadas.

Variante de ELISA muy sensible para detección de antígenos complejos (agentes patógenos). De manera secuencial y mediada por etapas de incubación y lavado, se tapizan los pocillos de una microplaca o la superficie de un inmunoadsorbente con anticuerpos purificados específicos del agente patógeno a detectar, se añade la muestra (extracto bruto vegetal, suspensión bacteriana, dilacerado, exudados, lloros de vid, extracto de suelo filtrado, etc.), y se añaden los mismos anticuerpos que en la primera etapa, pero conjugados con una enzima (habitualmente fosfatasa alcalina). La reacción se revela con el substrato específico de la enzima marcadora (habitualmente p-nitrofenil fosfato) que por hidrólisis y efecto batocrómico producirá un color amarillo (valor ELISA a 405 nm) de intensidad proporcional a la enzima retenida. La reacción clásica y más sensible, se realiza añadiendo 200 L/pocillo de la microplaca en cada etapa, aunque para ahorro de reactivos y economía algunos kits comerciales utilizan solo 100 L/pocillo. Otras modalidades utilizan únicamente unos microlitros Los anticuerpos utilizados para tapizar o como conjugados pueden ser producidos en la misma especie animal o no. Frecuentemente se utilizan anticuerpos policlonales para tapizado y monoclonales específicos (solos o en mezcla de varios) como conjugados, o ELISA basado completamente en anticuerpos policlonales, en anticuerpos monoclonales o recombinantes de anticuerpos monoclonales, que confieren alta especificidad y sensibilidad. DAS es la modalidad más popular de ELISA para detección de agentes patógenos o sus metabolitos.

Variante de ELISA para detectar antígenos o para titular anticuerpos, en la que se evita realizar conjugados de los anticuerpos específicos en laboratorio. El inmunoadsorbente o microplaca se tapiza con fragmentos F(ab’)2 de IgG obtenidos mediante una sencilla digestión de los anticuerpos con pepsina, el antígeno se detecta con anticuerpos completos (de la misma fuente u origen anterior o de diferente) y finalmente, la reacción se revela mediante proteína A conjugada con enzimas u otro producto para otras aplicaciones (la proteína A reacciona con la porción Fc de las inmunoglobulinas completas). La proteína A comercializada posee una calidad contrastada y es distribuida por numerosas empresas.

Acrónimo del inglés. Denominación en desuso.

Variante de ELISA usada para detectar antígenos, establecer parentescos serológicos entre ellos o titular anticuerpos en diluciones seriadas. Sobre una microplaca o un inmunoadsorbente tapizado con antígeno (o muestra en la que desea verificar la presencia del antígeno de interés), se añaden los anticuerpos específicos del antígeno y tras incubación y lavado se añaden inmunoglobulinas anti la especie animal utilizada para obtener los anticuerpos específicos, marcadas con una enzima o biotiniladas Esta modalidad evita tener que preparar conjugados para cada anticuerpo específico y como quiera que las inmunoglobulinas anti especie son muy utilizadas en análisis clínicos, están disponibles comercialmente con una alta calidad contrastada. Las más usuales son las de cabra anticonejo para anticuerpos policlonales de antisueros o de cabra antirratón para anticuerpos monoclonales, marcadas con fosfatasa alcalina o peroxidasa.

Variantes de ELISA en las que se tapiza el inmunoadsorbente con proteína A y seguidamente se añaden los anticuerpos para captar antígeno, con lo que se logra que prácticamente todos los anticuerpos de tapizado queden inmovilizados en el inmunoadsorbente en posición idónea para reconocer al antígeno, puesto que quedarán fijados por su porción Fc y exhibirán sus cadenas variables con sus paratopos libremente. También se suele aplicar el término a aquellas modalidades de ELISA en la que se utilice proteína A conjugada, tanto para sustratos soluble como para precipitantes.

Acrónimo del inglés. En español, ELISA de triple sándwich de anticuerpos.

Proceso de enriquecimiento semiselectivo o selectivo en la misma microplaca ELISA tapizada con anticuerpos policlonales en la que directamente se realizará la detección serológica con anticuerpos monoclonales específicos, normalmente mediante ELISA DASI. También se puede realizar mediante ELISA directo o indirecto, utilizando microplacas no sensibilizadas, no tapizadas con anticuerpos.

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

Recipiente estándar en investigación y laboratorios de diagnóstico, de 127,6 x 85,75 mm, adaptado a la automatización y pipetas múltiples. Diseñada con 96 pocillos en forma de tubo de fondo plano, de capacidad máxima 350 L, aunque se fabrican de menor volumen/pocillo para técnicas ELISA de formato especial, Su formato es de 12 columnas de pocillos, numeradas de 1 a 12 y de ocho filas, marcadas con letras de A a H. Su fondo es generalmente plano para permitir lectura espectrofotométrica a través del contenido del pocillo (espesor estándar del fondo 1,20 mm), aunque existen disponibles de fondo en U y en V. Fabricada con poliestireno rígido de gran claridad (también está comercialmente disponible en policloruro de vinilo-PVC flexible o rígida). Las placas se distribuyen con o sin tapa, estériles o no, de alta o baja adherencia y empaquetadas individualmente o en otros formatos, generalmente de cinco placas/paquete.

Densidad óptica obtenida tras incubación y lectura del sustrato hidrolizado en un lector ELISA o en un espectrofotómetro. Se efectúa a 450 nm para la fosfatasa alcalina como enzima marcadora, o a 405 nm para la peroxidasa, las dos enzimas más utilizadas para conjugar anticuerpos en laboratorios de fitopatología.

En la técnica inmunoenzimática (ELISA), valor medio de la densidad óptica de los pocillos de la muestra en cuestión (normalmente dos), obtenida tras hidrólisis del substrato utilizado, que proporciona un valor igual o mayor que el doble del obtenido con el valor medio del control negativo (extracto de material vegetal sano), en el mismo tiempo y temperatura de incubación del sustrato. Generalmente, este umbral es aplicable siempre y cuando el valor ELISA de la muestra analizada sea superior a 0,1 de densidad óptica.

1. Acción y efecto de adsorber. 2. Proceso de atracción de las moléculas o iones de una sustancia en la superficie de otra, siendo el tipo más frecuente el de la adhesión de líquidos y gases en la superficie de los sólidos mediante enlaces químicos o físicos y la de proteínas como los anticuerpos o antígenos en la superficie de placas o tubos ELISA, normalmente de poliestireno, durante su sensibilización o tapizado.

Tipo de técnica serológica de aglutinación en la que los antígenos o los anticuerpos están marcados con látex, bentonita o metales en estado coloidal, con el fin de facilitar la formación de flóculos detectables a simple vista o bajo lupa binocular. Es más sensible que la aglutinación simple y se aplicó extensivamente para la detección de virus de la patata o papa en programas de certificación, antes de la puesta a punto de la técnica ELISA.

Hace referencia a un leve error positivo en los resultados de una prueba o test, como consecuencia de los propios reactivos utilizados o soportes de la reacción, como placas de microtitulación ELISA. Generalmente las compañías de diagnóstico hacen lo posible, e incluso en ocasiones garantizan, que sus reactivos poseen valores despreciables de blancos. Normalmente, si existen, suelen ser muy reducidos, de manera que no tienen efecto alguno en la exactitud de las pruebas o tests. El valor del blanco de reactivo es de máxima importancia a la hora de efectuar mediciones y deducciones de resultados, especialmente durante las mediciones de bajas concentraciones. Para medir el blanco de reactivo, se suele utilizar agua desionizada estéril y de alta calidad o el tampón de extracción usado (habitual en técnicas ELISA) o agua fisiológica tamponada, incluso sustrato enzimático, en lugar de la muestra y se efectúa la prueba o test normalmente, según el protocolo. Seguidamente, se sustrae el valor de blanco de reactivo al valor de los resultados de la muestra. El valor de blanco de reactivo puede cambiar entre distintos lotes de reactivos o soportes de reacción. Por tanto, debe medirse el blanco de reactivo cada vez que utilice un lote diferente de reactivos o soportes de reacción, como placas de microtitulación ELISA, o tubos o placas de PCR.

Polisacárido lineal de origen vegetal constituido por residuos de glucosa unidos mediante enlaces del tipo 13 (1,3 -D glucano). Se acumula en los tubos cribosos durante los procesos de diferenciación e inactivación y, en ocasiones, en las paredes celulares como respuesta a una lesión o a la infección. El test de la calosa, basado en coloración de la misma en cortes histológicos del floema, se utilizó extensivamente para la selección sanitaria de patata o papa de siembra con la finalidad de eliminar lotes infectados con Potato leaf roll virus-PLRV, en la década de 1960-70, antes de ponerse a punto la técnica serológica ELISA.

1. Parte de la planta que une el tallo con la raíz. Es una estructura de orientación vertical que comprende tejidos de tallo o de raíz incluidos en la zona del hipocotilo de la semilla y que persisten y se lignifican, al menos en parte. En especies herbáceas vivaces, se compone de varias ramas que constituyen la base del tallo de cada año, salen de la base del tallo viejo cuando muere tras florecer y dan lugar a nuevas raíces adventicias. 2. Específicamente en el tubérculo de la patata o papa, zona generalmente opuesta diametralmente al ombligo (punto de unión del tubérculo con el estolón), es una zona rica en yemas (ojos) y que contiene el botón o yema principal. Posee importancia para la detección de virus pues en dicha zona se alcanza la mayor concentración o título de muchos de ellos, como del virus Y de la patata o papa (Potato virus Y-PVY), por ello, se recomienda pinchar en ella con el extractor de Gugerli para análisis más fiables mediante la técnica ELISA. 3. En plantas leñosas (árboles, arbustos, lianas o bejucos) se refiere a las ramas, hojas y las estructuras reproductivas que se extienden desde el tronco o los tallos principales. 4. Parte de la remolacha en la que se insertan las hojas, que es eliminada junto a las mismas, por carecer de azúcar. 5. Conjunto de ramas y hojas que forma la parte superior o aérea de un árbol o arbusto.

Esteroide que se encuentra exclusivamente en las flores y las hojas de las especies Digitalis purpurea, D. orientalis y D. lanata. Es un hapteno que se utiliza frecuentemente como molécula señal o marcador en inmunología e hibridación molecular, para el revelado de reacciones como otros marcadores (biotina o fluoresceína). Habitualmente, la digoxigenina se introduce químicamente por conjugación, en biomoléculas (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos) para ser detectados en ensayos adicionales. Son muy populares los anticuerpos anti-digoxigenina, ya que se utilizan en una extensa gama de ensayos inmunológicos como ELISA, electrotransferencias, etc. e hibridaciones moleculares e hibridación in situ y confieren gran sensibilidad a la reacción. De hecho, el uso de precursores no radiactivos para marcar ácidos nucleicos ha hecho a la hibridación molecular más accesible. El precursor no radioactivo más utilizado son los derivados de la molécula DIG, que está unido a través de un brazo espaciador (once residuos de carbono) a uridín-nucleótidos, y se incorpora enzimáticamente en los ácidos nucleicos mediante métodos estándar.

Dispositivo que incorpora una cantidad predeterminada de líquido o medio de cultivo con agar a una placa de Petri, tubo de cultivo microbiológico, placa de microtitulación o de ELISA, fermentador, vial o a cualquier recipiente de laboratorio. La dispensación puede realizarse estérilmente y de forma manual o automática programada, incluso en su temperatura.

Proceso de incremento artificial de las células bacterianas presentes en un extracto o dilacerado de una muestra, mediante adición de un medio de cultivo líquido, preferiblemente semiselectivo o selectivo de la bacteria diana, e incubación adecuada. El enriquecimiento aumenta la sensibilidad de detección de técnicas de aislamiento, inmunológicas (inmunofluorescencia o ELISA), de hibridación molecular y de amplificación molecular (PCR y PCR en tiempo real). Su ventaja es que permite detectar células viables. Se puede aplicar a microorganismos que puedan ser cultivados in vitro.

1. Conjunto de técnicas que permiten comprobar y valorar cuantitativamente la presencia de anticuerpos en la sangre de animales inmunizados, de anticuerpos monoclonales en hibridomas segregantes o de anticuerpos recombinantes establecidos in vitro o expresados en fagos, levaduras, bacterias, o in planta. 2. Prueba en la que se emplean anticuerpos específicos para detectar los antígenos (agentes patógenos o sus metabolitos), cuantificar su número y establecer relaciones de parentesco serológico mediante técnicas in vitro entre las cuales las más utilizadas actualmente en Fitopatología son las inmunoenzimáticas ELISA y la inmunofluorescencia.

En un sistema de gestión de la calidad, en general, aparatos necesarios para cualquier operación. Más específicamente, los medios físicos necesarios para realizar una medición analítica; por ejemplo, un lector de placas ELISA o un termociclador en tiempo real.

1. Igualdad en el valor, estimación, potencia, parámetros de diagnóstico, virulencia o eficacia de dos o más cosas, kits, patógenos, vectores o personas. 2. Factor que interviene en la reacción antígeno-anticuerpo en algunas técnicas serológicas de aglutinación y precipitación, por el cual solo se produce la reacción cuando se dan ciertas concentraciones relativas de antígeno y de anticuerpo (zona de equivalencia), no produciéndose la reacción en situaciones de exceso o defecto de uno y otro. Ello afecta a la sensibilidad de la detección de estas técnicas serológicas, y por ello están en desuso. No se produce en técnicas serológicas como inmunofluorescencia o ELISA.

Parte del informe de ensayo en un sistema de gestión de la calidad según las directrices para la acreditación de la entidad de Acreditación de España (ENAC). Establece la información que debe ser incluida en un informe de ensayo y cómo debe ser estructurada. Se informará cada resultado analítico de cada método de ensayo de manera independiente. Asimismo, cada resultado debe ser expresado de forma exacta, clara, objetiva y libre de ambigüedad. El resultado, por lo tanto, se informará como: i) Positivo (incluyendo valor, si aplica). Siempre que esté técnicamente justificado y previo acuerdo con el cliente, puede utilizarse otra expresión (por ejemplo: presencia, detectado, se observa…, aislamiento de…, identificación de…). Asimismo, cuando sea necesario pueden incluirse como parte del resultado otros datos inherentes al ensayo, como por ejemplo el valor ELISA (densidad óptica de la muestra) o ciclo de corte en PCR a tiempo real (Ct o Cq); ii) Negativo. Siempre que esté técnicamente justificado y previo acuerdo con el cliente, puede utilizarse otra expresión (por ejemplo: ausencia, no detectado, no se observa…, identificación negativa de… o; iii) Resultado no concluyente. En este caso será necesario incluir comentarios en el informe de ensayo para que este resultado sea comprensible para el destinatario. Por ejemplo, para aportar información sobre la conveniencia de repetir el ensayo en una nueva muestra, la realización de nuevos ensayos adicionales o sobre las limitaciones de las técnicas o ensayos aplicados. Estos comentarios se deberán documentar y estandarizar en el apartado de expresión de resultados del procedimiento de ensayo.

Denominación común del extractor de jugos Tecan 400 diseñado por el Dr. Paul Gugerli en 1979 para realizar automáticamente numerosos extractos de tubérculos de patata o papa, diluirlos en un tampón apropiado, dispensarlos directamente en la placa ELISA, descontaminar la fresa de extracción y conductor de aspiración y dispensación con un lavado rápido de tampón a presión y lavado-secado al vacío. Para ciertos virus el pinchazo con la fresa para realizar el extracto debe efectuarse en la zona de la corona del tubérculo, mientras que para otros conviene más la zona próxima al ombligo, para incrementar las posibilidades de detección. El sistema revolucionó el análisis de muestras mediante la técnica ELISA pues permite realizar una muestra por minuto y unas 20 placas por operador y jornada laboral. Es aplicable al análisis de virus en tubérculos, raíces engrosadas, bulbos y otro material vegetal suculento.

Fragmento de anticuerpo (IgG) obtenido al tratar las cadenas pesadas con pepsina, que genera un solo fragmento denominado F(ab’)2 en el que los dos dominios Fab permanecen unidos a través de la región bisagra, y otro fragmento Fc’, ligeramente diferente al obtenido tras tratamiento con papaína (fragmentado en varios péptidos, pues la pepsina tiene varias dianas en la cadena H). Son útiles para técnicas de detección basadas en ELISA.

Fragmento de anticuerpo (IgG) obtenido al tratar las cadenas pesadas con papaína. Cada fragmento Fab separado es aún capaz de unirse a una molécula de antígeno. Son útiles para técnicas de detección basadas en ELISA.

Enzima que cataliza la hidrólisis de ésteres de fosfato. Se utiliza para diversos protocolos experimentales, que incluyen, entre otros, la eliminación de grupos fosfatos de moléculas de ADN (para evitar la religación de vectores en un experimento de clonación, por ejemplo) y técnicas inmunológicas. La enzima procedente de la mucosa intestinal de ternera es la más utilizada en la técnica ELISA en Fitopatología y en inmunodetección en general, para marcar anticuerpos y proteína A. Su sustrato soluble es el p-nitrofenil fosfato en dietanolamina a pH 9,8. Su hidrólisis produce una coloración amarilla muy intensa en disolución alcalina, cuantificable espectrofotométricamente a 405 nm. Si se utiliza un sustrato cromogénico precipitante de cloruro de nitroblue tetrazolio (nitroazul de tetrazolio) o NBT con 5-bromo 4-cloro 3-indolil fosfato (BCIP), produce precipitados color azul oscuro a púrpura. Es muy utilizado para localización de patógenos (especialmente de virus) por inmunodetección (inmunohistoquímica e inmunoimpresión-ELISA) y en inmunoelectrotransferencia. Ambos sustratos están disponibles comercialmente en forma de pastillas para su disolución en agua.

Aquel de anticuerpo obtenido mediante hidrólisis con pepsina de una molécula de inmunoglobulina. Consiste en dos fragmentos de Fab unidos por puentes disulfuro. Se han utilizado en técnicas ELISA al carecer de cadena pesada.

Instrumento de laboratorio que consta de un recipiente normalmente de plástico, que se caracteriza por ser de forma cilíndrica y tener un pico largo de desagüe por el que fluye el líquido contenido en su interior al ejercer ligera presión sobre el recipiente. Su función básica es de limpieza o enjuague. En su interior generalmente contiene algún solvente (agua destilada, desmineralizada o agua fisiológica, tampón lavador, etanol, metanol, hexano, etc.), que se emplea para dar el último enjuague al material de vidrio después de su lavado, en la preparación de disoluciones y en lavados tras reacciones secuenciales como en la técnica ELISA y otras.

Instrumento que consta de un vástago metálico sobre el que gira, uno concéntrico provisto de dientes de acero o cuchillas a altas revoluciones (regulable hasta 5.000 rpm). Tienen la misión de homogeneizar y dispersar. Los trozos sólidos de material vegetal, previamente seccionado por fuerzas de cizalladura en el seno de un líquido (tampón apropiado de extracción), van disminuyendo de tamaño conforme gira el vástago durante unos segundos, hasta constituir un extracto. Existen disponibles vástagos de diferente diámetro aptos para ser introducidos en tubos de ensayo, vasos de precipitado o matraces. Son muy utilizados para preparar extractos utilizables en técnicas de detección ELISA. La contaminación cruzada que pueden generar entre muestras, se reduce lavando el vástago entre ellas con agua y durante unos segundos a altas revoluciones en agua o tampón de extracción con hielo picado seguido de un somero secado del vástago con papel absorbente. Son muy populares los modelos de homogeneizadores dispersadores de Polytron (Kinematika), Ultra Turrax o Wiggenhauser.

Marca comercial de instrumento de laboratorio que permite la realización casi automática de homogeneizados de material vegetal suculento (hojas, flores, peladuras de frutos, raicillas, o brotes herbáceos) en bolsas de plástico de preparación de extractos. Permite el tratamiento consecutivo de varias bolsas con muestra (hasta ocho) pudiendo regular el tiempo de funcionamiento en cada muestra y la velocidad de giro de los rodillos de rodamientos. Un operador puede procesar unas 250 muestras por hora, utilizables para técnicas ELISA, de hibridación molecular o de amplificación molecular por PCR. El sistema evita la contaminación cruzada entre muestras.

Vocablo inglés, también utilizado comúnmente en español. Se refiere al conjunto de procedimientos o pruebas biológicas con una serie o gama de plantas indicadoras, normalmente leñosas inoculadas por injerto, para detectar la presencia de agentes patógenos transmisibles por injerto del material vegetal analizado (algunas bacterias, entre ellas todos los fitoplasmas, micoplasmas entre ellos los espiroplasmas, algunos hongos y oomicetos, virus y viroides). El término también incluye a las pruebas biológicas con una serie de plantas indicadoras herbáceas inoculadas mecánicamente. El procedimiento general consiste en tomar material de una planta problema a analizar y transferirlo por injerto o inoculación mecánica a otra planta (denominada indicadora) que desarrollará, tras un período de tiempo variable, síntomas más o menos característicos del patógeno buscado, caso de estar presente. Normalmente, las plantas inoculadas son mantenidas en las condiciones más apropiadas para la expresión de la infección. La manifestación de síntomas sucede en días en el caso de plantas indicadoras herbáceas, pero en los indicadores leñosos transcurren generalmente meses. El método es muy sensible pues permite la multiplicación del patógeno inoculado por injerto en la planta indicadora hasta provocar síntomas. Se ha realizado extensivamente durante décadas para selección sanitaria en la práctica totalidad de cultivos leñosos y algunos herbáceos como la fresa, antes de la aplicación de otras tecnologías como las serológicas ELISA, la hibridación o la amplificación molecular por PCR en tiempo real o la secuenciación masiva. Posibilita la detección de agentes patógenos transmisibles por injerto, aún de los de etiología desconocida, razón por la que se continúa utilizando en algunos casos específicos y países. Actualmente es habitual simultanear pruebas sensibles y específicas de laboratorio (por ejemplo, se usa la inmunoimpresión-ELISA con anticuerpos monoclonales o RT-PCR en tiempo real, para detección fiable del virus de la tristeza de los cítricos, Closterovirus tristezae o Citrus tristeza virus-CTV, sustituyendo a la clásica planta indicadora de lima mexicana). Así, se logra reducir el uso de plantas indicadoras que resulta lento, caro, no suficientemente específico y precisa personal especializado para la lectura de síntomas y espacio de invernadero o cámara climática para la realización de las pruebas. No obstante, constituye una prueba definitiva, y frecuentemente única, para demostrar la patogenicidad y valorar la agresividad de un agente patógeno en distintos huéspedes o anfitriones. 2. En ocasiones, se utiliza el término para referirse de modo amplio a una serie de pruebas, no solamente de inoculación en plantas indicadoras, para conocer el estado sanitario de una planta o sus productos (bulbos, semillas, tubérculos, etc.) a modo de cribado.

1. Proceso físico o químico utilizado para fijar enzimas, anticuerpos u otras proteínas, ácidos nucleicos, bacterias, hongos, oomicetos, extractos vegetales de plantas infectadas por virus o viroides y cultivos de células animales o vegetales, o bien orgánulos obtenidos de los mismos, a un soporte o atraparlos en una matriz sólida. Los inmovilizados se utilizan frecuentemente para detección y diagnóstico, como en las técnicas de inmunofluorescencia, ELISA o inmunocaptura-PCR o como biocatalizadores en procesos de flujo continuo, como en columnas de cromatografía. Existen diversos métodos de inmovilización: i) inclusión en membranas semipermeables; ii) atrapado en materiales poliméricos, como acetato de celulosa, acrilamida, alginato, etc.; iii) adsorción sobre soportes cargados eléctricamente; iv) absorción sobre soportes porosos; v) unión covalente a un material de soporte activado, o vi) entrecruzamiento de proteínas o células, empleando o no, material de soporte. 2. Conversión de un elemento desde formas inorgánicas a formas orgánicas integradas en microorganismos o en el tejido vegetal.

Prueba analítica basada en la alta especificidad de la interacción entre un anticuerpo y un antígeno. La medida de la interacción puede ser cuantitativa o semicuantitativa. La mayoría en Fitopatología se basan en técnicas ELISA o de inmunofluorescencia (o históricamente en aglutinación e inmunodifusión), o colaboran con técnicas de hibridación molecular o de amplificación molecular, para la captura de dianas o el revelado de la reacción.

Procedimiento serológico de diagnóstico, detección o identificación en el que se produce la reacción antígeno-anticuerpo al permitir que los reactivos se difundan entre sí en una matriz de gel. Cuando se da la equivalencia se produce la precipitación en el medio gelosado. Estas técnicas fueron muy utilizadas para comparar agentes patógenos y establecer parentesco serológico entre cepas o aislados e incluso utilizadas para detección en las décadas de 1950 a 1970, antes de la aplicación de la técnica ELISA.

Revelado inmunológico realizado sobre aquellos antígenos previamente separados electroforéticamente en un gel y posteriormente electrotransferidos a una membrana. Básicamente consiste en realizar una transferencia tipo Western y un posterior revelado mediante técnicas inmunoenzimáticas ELISA en un soporte sólido (generalmente membrana o gel).

Técnica serológica de localización de antígenos en secciones de tejido inmovilizadas o impresas en membranas de nitrocelulosa, éster de celulosa o papel. Las secciones de tejido de material vegetal recién cortado se impresionan contra la membrana suave pero firmemente, de manera que se permita la observación de la estructura de la sección. Las huellas o improntas de tejido inmovilizadas se revelan como en una técnica ELISA, frecuentemente directa, con el uso de anticuerpos específicos conjugados con la enzima fosfatasa alcalina. El revelado se realiza con substrato precipitante azul nitrotetrazolio (o cloruro de tetrazolio nitroazul) y 5-bromo-4-cloro indolil fosfato (NBT+BCIP). La presencia de acúmulos de precipitado violeta en la zona vascular indica infección para patógenos vasculares y acúmulos en otras zonas indican la presencia localizada de otros patógenos extracelulares, en función de los anticuerpos utilizados. Es extensivamente empleada en viveros y prospecciones para la detección rutinaria de Closterovirus tristezae (Citrus tristeza virus-CTV), pues es la técnica serológica de referencia usada con anticuerpos monoclonales específicos. La realización de la prueba es sencilla, no requiere de personal especializado para su ejecución que puede efectuarse en condiciones de campo de forma muy económica.

Denominación común del efectuado para detectar bacterias u otros organismos mediante un tampón apropiado o agua estéril absorbida a través de una sección de tallo o sarmiento, cuya base está depositada en un vaso de precipitado. El líquido se hace pasar a través del material vegetal por succión con una jeringa conectada a una goma elástica para asegurar la estanqueidad. Se han diseñado dispositivos manuales para la obtención de líquido de lavado interno de distintas muestras simultáneamente. También puede realizarse haciendo pasar líquido a través de la sección de material vegetal con ayuda de la presión realizada con una jeringa que contiene el líquido. Los primeros mililitros de líquido así obtenido se han utilizado para aislamiento, detección serológica (inmunofluorescencia o ELISA) o para amplificación molecular (PCR convencional o en tiempo real) de patógenos vasculares, como las especies bacterianas Xylophilus ampelinus o Xylella fastidiosa e incluso cepas tumorígenas de Allorhizobium vitis en vid.

Enzima que cataliza la hidrólisis de un enlace glucosídico -(1,4) entre residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina de un mucopéptido presente en la pared celular de muchas bacterias. Esta acción debilita la estructura covalente de la pared y disminuye su resistencia al choque osmótico, que provoca la destrucción de las células. Se ha utilizado como tratamiento para incrementar la sensibilidad analítica en técnicas ELISA de detección al permitir aumentar el número de dianas de reacción.

1. Capa sencilla de células que forman las células dependientes de anclaje en la superficie de la matriz de soporte sobre la que están creciendo. 2. Capa sencilla de anticuerpos para el tapizado de placas de ELISA que se logra sensibilizando previamente la placa con proteína A y añadiendo después anticuerpos, que además quedarán con sus paratopos libres y receptivos (orientados), al quedar fijados por su fragmento Fc. 3. Capa única de células bacterianas o fúngicas para tapizar placas y realizar ELISA directo, indirecto o inmunofluorescencia; la formación de multicapas de antígeno disminuye la sensibilidad al ser más fácilmente arrastradas durante los lavados.

Proceso de conversión de los valores brutos de una prueba para cada muestra problema en unidades de actividad respecto al estándar o estándares de trabajo. Los valores normalizados se pueden expresar de muchas maneras, como en porcentaje respecto al valor de un control positivo (como en una prueba ELISA), o como una concentración o título de un analito derivado de una curva estándar, o como un número de copias genómicas de la diana también derivadas de una curva estándar de valores Ct (umbral del ciclo) para PCR en tiempo real. Es una buena práctica incluir estándares de trabajo (o por lo menos una muestra razonablemente bien caracterizada) en todas las realizaciones durante el desarrollo y validación de la prueba, ya que esto permite una normalización de los datos, lo cual proporciona un medio válido para la comparación directa de los resultados entre las distintas ejecuciones de una prueba. Los sistemas automáticos de análisis permiten calcular y obtener estos datos mediante una curva estándar, o bien obtener el número del ciclo a partir del cual se está excediendo el umbral de ciclos, como en la PCR en tiempo real.