Diccionario

Muestra o porción de ácido nucleico (ADN o ARN) de origen y, generalmente, secuencia conocida, que se marca o conjuga con una sustancia delatora para ser posteriormente reconocida. Generalmente se suelen marcar con isótopos radioactivos, inmunomarcadores como biotina, proteína A, avidina, estreptavidina, digoxigenina, etc., o marcadores de color o fluorescencia.

Molécula de ADN marcada (con 32P, 35S, estreptavidina, biotina, proteína A, proteína verde fluorescente, etc.), utilizada para detectar moléculas de ácidos nucleicos de secuencia complementaria por medio de hibridación molecular.

Tipo de biosensor en el cual el catalizador o biorreceptor está inmovilizado con un instrumento de detección, como un electrodo enzimático (en el que el catalizador es un enzima) o un electrodo biosonda (en el que el catalizador suelen ser anticuerpos monoclonales específicos o células intactas).

Procedimiento para la detección simultánea de varias secuencias mediante la utilización de una sonda múltiple capaz de reconocer a un número variable de secuencias nucleotídicas, mediante hibridación molecular. El sistema supone la clonación en tándem de varios fragmentos genómicos distintos en un mismo vector plasmídico lo cual permite la síntesis en la misma reacción de transcripción, de una única sonda de ARN o ADN.

Técnica basada en la utilización de sondas de ADN para detectar (y, a veces, cuantificar) genes o secuencias nucleotídicas específicas y localizar dichos genes o secuencias en cromosomas metafásicos o núcleos en interfase. En este caso, la sonda (ADN o ARN) se marca por conjugación química directa con un fluorocromo, usualmente de la clase de las cumarinas, fluoresceínas, rodaminas o cianinas, o bien por conjugación química con una molécula no fluorescible, como la biotina o un hapteno (por ejemplo la digoxigenina o el dinitrofenol), capaz a su vez de unirse posteriormente a una segunda molécula marcada con un fluorocromo, como la avidina, en el caso de la biotina, o a un anticuerpo específico, en el caso del hapteno. Tras la hibridación y los lavados respectivos, la sonda se irradia, el fluorocromo emite luz de una determinada longitud de onda (y por consiguiente de un determinado color) y ello permite distinguir la secuencia complementaria como una mancha de color vivo al microscopio de fluorescencia, según definición del Vocabulario inglés-español de María V. Saladrigas (www.medtrad.org/panacea.html).

Alternativa a la mezcla de diferentes ribosondas para la detección múltiple basada en la hibridación molecular no isotópica. Esta estrategia consiste en la clonación en tándem de secuencias de ácido nucleico parciales de diferentes virus para permitir la síntesis de una ribosonda única. Se diseñó inicialmente para la detección simultánea de seis virus de frutales de hueso o carozo, y posteriormente para virus de tomate, virus y viroides de frutales y viroides de ornamentales, vid y frutales. La opción del uso de polisondas ofrece varias ventajas: i) solamente se necesita una reacción de síntesis para un gran número de virus/viroides, con el consiguiente ahorro de tiempo y costes, evitando así la variabilidad potencial en la eficiencia de las diferentes ribosondas; ii) a diferencia de la mezcla de ribosondas diferentes, esta estrategia no requiere el tratamiento con RNasa, necesario para evitar el fondo observado cuando altas cantidades de sondas de ARN-DIG están presentes en la solución de hibridación, y permite así la detección tanto de virus de ADN como de ARN en el mismo ensayo; y iii) posibilita el diseño de una “polisonda cultivo” específica para detectar diferentes virus/viroides y otros patógenos que afecten a un mismo cultivo.

Sonda de ARN, utilizada frecuentemente para detectar patógenos. Se sintetizan mediante la incorporación de digoxigenina (DIG) en un ARNc por medio de una reacción de transcripción in vitro a partir de ADNc viral o viroidal clonado. Las muestras (ácidos nucleicos) se fijan a una membrana de nilón cargada positivamente, mediante tratamiento de 2 horas a 80 o a 120 °C durante 30 minutos, o por tratamiento con luz ultravioleta (UV). La fijación por tratamiento con UV aumenta de cinco a 10 veces, la fijación respecto a los tratamientos con calor.

Técnica analítica recientemente aplicada para el diagnóstico de enfermedades de las plantas. Se basa en el estudio y comparación de curvas de fusión de las cadenas de ADN. Sus principales aplicaciones son la detección de mutaciones, polimorfismos y alteraciones epigenéticas en muestras de ADN. Este método tiene ventajas sobre la PCR convencional estándar, ya que no requiere la visualización de bandas de ADN ni el uso de las sondas necesarias para PCR cuantitativa. Esta nueva herramienta de diagnóstico en Fitopatología basada en amplificación molecular es capaz, por ejemplo, de detectar el hongo Colletotrichum abscissum en cítricos durante sus etapas asintomática y sintomática.

1. Segmento de ARN con nucleótidos complementarios de un ARN mensajero, que se une a él evitando que se traduzca la proteína codificada por dicho ARN mensajero, regulando así la expresión génica. 2. Molécula de ARN (sintética o natural) sintetizada in vitro que servirá de sonda en experimentos de hibridación molecular.

Método de aislamiento de uno varios genes cromosómicos basado en la construcción previa de un denso mapa físico de marcadores moleculares circunvecinos del gen de interés. Tras la construcción de la genoteca genómica respectiva, el gen simplemente se aísla utilizando como sonda uno o más de dichos marcadores, para localizar el o los clones que contienen el gen.

Acrónimo del inglés. En español, herramienta básica de búsqueda de alineación local, un algoritmo utilizado para la comparación de secuencias, como las de nucleótidos de ADN o las de aminoácidos de proteínas, con el fin de encontrar regiones similares entre dos secuencias y deducir relaciones de homología. Generalmente, las búsquedas se realizan utilizando bases de datos públicas que pueden contener millones de secuencias, aunque también es posible realizar búsquedas utilizando bases de datos construidas por el usuario. El programa usa un algoritmo heurístico seguido de una búsqueda por programación dinámica (de Smith-Waterman, modificada), por lo que ofrece una búsqueda muy rápida y encuentra soluciones satisfactorias, aunque no puede garantizar que haya encontrado la solución óptima. Además, el programa calcula diversos parámetros, como bit-score y E-value, que permiten evaluar la probabilidad de que el alineamiento sea fruto del azar teniendo en cuenta la longitud de la secuencia problema y el tamaño de la base de datos. Existen distintos tipos de programas BLAST para el análisis de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos; dependiendo del tipo de secuencia problema y de la base de datos utilizada, estos programas son (secuencia problema/base de datos): blastn y megablast, nucleótidos/nucleótidos; blastp, proteínas/proteínas; blastx, nucleótidos traducidos en las seis pautas/proteínas; tblastn, proteína/nucleótidos traducidos en las seis pautas; tblastx, nucleótidos traducidos en las seis pautas/nucleótidos traducidos en las seis pautas. Igualmente, existen algoritmos especializados de blastp, como PSI-BLAST o DELTA-BLAST, que son más rápidos o más sensibles, o que permiten buscar patrones. Generalmente el primer paso en el diseño de iniciadores consiste en el alineamiento de las secuencias de interés mediante el programa Advanced BLAST diseñado para el análisis de nucleótidos, que facilita la selección de regiones conservadas para el diseño de iniciadores y sondas adecuados para detección. La implementación de BLAST más utilizada es la que aloja el National Center for Biotechnology Information (NCBI)

La conductividad y la cantidad de sólidos disueltos son parámetros de calidad del agua, que se emplean para describir el nivel de salinidad. Se mide con un medidor electrónico o con una tira reactiva, a 25 °C. En aguas dulces se utilizan con frecuencia las cantidades totales de sólidos disueltos (TSD) en vez de la salinidad. Se mide filtrando una muestra, secando el agua filtrada y pesando los sólidos restantes. Los TSD son las materias sólidas que quedan en el agua después de haberse evaporado, que se valoran en mg/L o ppm. Algunas sondas de conductividad expresan los resultados en conductividad, así como las cantidades totales de sólidos disueltos. Estas sondas asumen una relación constante entre la conductividad y las TSD.

Distribución ordenada de una colección de moléculas de ADN (oligonucleótidos) inmovilizada en un soporte sólido, generalmente vidrio o nailon, y que se somete a hibridación con sondas de ADN o ARN marcadas. Las aplicaciones de esta tecnología permiten medir simultáneamente el nivel de expresión de miles de genes, el genotipado, la detección de mutaciones y polimorfismos de un único nucleótido (SNPs), su número de copias, etc. El funcionamiento de los chips de expresión se basa en la capacidad de las moléculas complementarias de ADN de hibridar entre sí. Pequeñas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes cuya expresión se desea medir, son depositadas en una base de vidrio, plástico o silicona. Para ello se utilizan robots de precisión que usan agujas especiales para obtener las moléculas y depositarlas en las coordenadas adecuadas. Las muestras de ADN depositadas en el chip se denominan dianas. Una superficie de 2 x 2 cm puede contener más de 10.000 dianas en forma de pequeños puntos separados. De las células que queramos medir su expresión se obtiene una muestra de ARN que se convertirá en ADN complementario (ADNc) y se marcará con una molécula fluorescente. Esta muestra marcada se denomina sonda y se enfrentará a las dianas del chip para hibridarse con ellas y quedar fijada. Después de un tiempo para que la mayoría de las cadenas complementarias hibriden, el chip se lava y se procede a efectuar una medición relativa de la cantidad de ADN de la sonda que ha quedado fijada en cada diana.

Propiedad de los cuerpos de transmitir el calor o la electricidad. La salinidad del suelo o agua de riego y la conductividad están relacionadas porque la cantidad de iones disueltos aumentan los valores de ambas. Las sales y también otras sustancias afectan la calidad del agua potable o de riego, e influyen en la microbiota acuática y cada microorganismo tolera una gama de valores de conductividad. La conductividad se mide con una sonda electrónica que aplica un voltaje entre dos electrodos. La disminución del voltaje se usa para medir la resistencia del agua que se traduce a conductividad. La conductividad es el valor inverso de la resistencia y se mide como la cantidad de conductancia en una distancia determinada. Las unidades son millihoms/cm (mhos/cm) o Siemen (S): 100 mhos/cm = 100 S/m).

Tecnología reciente para la preparación de sondas de hibridación de ADN activadas por fluorescencia dirigidas a secuencias de ARNm específicas. Se basa en la conjugación de un intercalador no fluorescente en la base de un ácido nucleico (como uracilo) a través de un espaciador flexible. Este monómero modificado se puede incorporar a los oligonucleótidos mediante síntesis en fase sólida. Se observa una gran mejoría de la fluorescencia cuando el nucleótido modificado se hibrida con su cadena complementaria debido a la intercalación del fluoróforo entre las dos cadenas.

1. Célula, tejido, órgano o molécula al que se dirige la acción de un reactivo (producto químico, producto ionizante, conjugado, enzima, substrato, fotón, luz ultravioleta, anticuerpo, sonda, producto fitosanitario, ácido nucleico, medicamento, enzima, etc.). 2. Fin u objeto a que se dirigen deseos o acciones (reactivos) de detección, diagnóstico o identificación, generalmente a través de la observación (directa o microscópica) o mediante reacciones analíticas apropiadas.

Denominación común en hibridación molecular para referirse a las moléculas sonda-muestra.

Instrumento para medir la concentración de iones hidrógeno en una solución. Normalmente consiste en un electrodo de platino que, como una sonda simple y compacta, presenta la mayor parte de su longitud protegida electrostáticamente.

1. Compuesto químico que se une covalentemente a una sonda de ADN para posibilitar la posterior reacción con un compuesto señal. 2. Compuesto químico utilizado para unir a la matriz soporte el primer nucleótido protegido en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. 3. Fragmento de ADN que codifica un segmento peptídico flexible, utilizado para conectar los genes de las regiones variables (V) de la misma cadena o de cadenas distintas de anticuerpos. De esta manera se han obtenido fragmentos recombinantes de anticuerpos en los que las regiones VH y VL están unidas por un engarce peptídico; estas estructuras se denominan scFv (cadena simple Fv). 4. Segmento de ADN que conecta los nucleosomas entre sí en los organismos eucariotas.

Técnica analítica utilizada para reconocer ADN recombinante en células clonadas. Las células transformadas representan un pequeño porcentaje de la población total de células en un cultivo. El cultivo se diluye y siembra en una placa de Petri hasta que forme colonias individuales que se ponen en contacto con un disco de membrana de nitrato de celulosa, nailon, o papel (en una posición equivalente a la de las colonias), después se lisan las células y el filtro se trata para favorecer la adherencia del ADN. Al tratar la membrana con una sonda que hibride con el ADN transformado, se localizan las colonias transformadas mediante autorradiografía, o más comúnmente por anticuerpos fluorescentes.

Sigla del inglés. En español, Hibridación Fluorescente in situ. Técnica en principio citogenética de marcado de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia, lo que permite su visualización, distinción y su estudio, así como el análisis de las anomalías que puedan presentar. Se utiliza en Fitopatología para detectar y localizar una secuencia específica de ADN en un cromosoma o un fragmento de ADN en el genoma de una planta, insecto o patógeno, en el propio lugar o tejido de la búsqueda.

Nombre genérico que se aplica a cualquier variante de la técnica de hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas individualmente con un fluorocromo específico o una combinación de fluorocromos distintos, que proporciona una imagen polícroma de los cromosomas, del cariotipo, o de la hibridación específica realizada.

Variante de FISH multicolor en la que la visualización policroma simultánea de los cromosomas metafásicos o de la hibridación específica realizada, se logra mediante marcado combinatorio de las sondas con varios fluorocromos y con ayuda de un microscopio de fluorescencia, equipado con una serie de filtros ópticos específicos de los fluorocromos utilizados. Un programa informático complejo combina las imágenes obtenidas sucesivamente con cada filtro en una única imagen de los cromosomas en colores artificiales distintos.

Existen diferentes sistemas para la detección de la fluorescencia generada durante el proceso de amplificación mediante PCR. Los dos principales son el uso de substancias no específicas que emiten fluorescencia cuando se intercalan entre las dobles cadenas de ácidos nucleicos (SYBR-Green®), o las sondas específicas directamente marcadas con fluoróforos o moléculas fluorescentes (TaqMan®, molecular beacons, Scorpions®, etc.). El SYBR-Green® es un compuesto orgánico de fórmula química C32H37N4S, que forma parte del grupo de las cianinas asimétricas y se une a los amplificados de manera inespecífica emitiendo fluorescencia independiente de la secuencia del DNA, no es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. El complejo resultante ADN-SYBR Green® presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, por ello su denominación). En este caso es necesario realizar un segundo análisis de sus respectivas curvas de fusión para diferenciar los tamaños y composición de las secuencias amplificadas. En cambio, las sondas específicas marcadas con un fluoróforo están diseñadas para hibridar con una región específica del ADN, interna al producto de PCR de un determinado patógeno, alcanzando así la máxima especificidad y sensibilidad.

Principio que permite realizar hibridaciones en poco tiempo al dirigir el flujo de las moléculas a hibridar (muestra) hacia sondas diana inmovilizadas en una membrana, mediante succión a través de la misma. Igualmente, los lavados y revelado se realizan mediante ligero vacío a través de la membrana, tras breve tiempo de incubación.

La de una sonda con unas moléculas que presentan un apareamiento imperfecto (menos de 100 % de identidad).

Aquella en la que se inmoviliza el ADN o ARN de la muestra desnaturalizado sobre un soporte sólido o filtro, de forma que se impide la autohibridación, que puede ocurrir en medio líquido. Seguidamente se introduce el soporte en una solución con sondas de ácidos nucleicos complementarios y marcados con una molécula delatora. Tras la hibridación y lavado para eliminar los productos que no hayan reaccionado, los híbridos se detectan por autorradiografía, caso de sondas marcadas con 32P o, en la actualidad más frecuentemente, por variados métodos inmunoenzimáticos disponibles. Es la modalidad de hibridación molecular más común que implica la aplicación de una solución de ácido nucleico a un soporte sólido, tal como membranas de nitrocelulosa o de nailon, y la posterior detección con sondas específicas apropiadas.

Técnica analítica y de detección en la que una sonda de ADN o ARN marcada radiactivamente se hibrida con material celular fijado. Una autorradiografía de la preparación revela la localización precisa de las secuencias de ADN implicadas en la hibridación. En el ámbito de la Patología Vegetal, se utiliza fundamentalmente para localizar genes o secuencias de agentes patógenos en cromosomas, células y tejidos fijados.

Denominación común de la hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN), que en el campo de la Patología Vegetal se aplica con frecuencia a la detección e identificación de patógenos de vegetales. Su potencial como herramienta de diagnóstico se demostró primero para la detección de viroides y posteriormente para virus. Asociación de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar una cadena doble que contenga dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una de ADN y una de ARN. Se emplea para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Se basa en la interacción específica entre las bases púricas y pirimidínicas complementarias que forman pares A-T y G-C, lo que resulta en un híbrido estable formado por parte, o la totalidad, de la secuencia del ácido nucleico del patógeno a detectar (molécula diana) y en la secuencia complementaria marcada (sonda). La estabilidad del híbrido depende del número de enlaces de hidrógeno formado y de las fuerzas electrostáticas e hidrófobas. Las fuerzas electrostáticas son debidas a las moléculas de fosfato del esqueleto del ácido nucleico, mientras que las interacciones hidrofóbicas se mantienen entre las bases apiladas. La detección de agentes fitopatógenos, como los virus, se realiza mediante la unión del ácido nucleico del genoma viral con moléculas de ácido nucleico complementario (sonda), que han sido marcadas con un isótopo radiactivo u otra molécula no radiactiva, como la biotina, avidina, proteína A, digoxigenina, proteína verde fluorescente-GFP, etc., que permite detectar, localizar, incluso valorar de forma cuantitativa, la hibridación ocurrida. Los principales factores que afectan a la reacción de hibridación son: la longitud y la composición de bases de la sonda, la temperatura, la concentración de sales, el pH, la concentración de formamida y el grado de identidad entre muestra y sonda. Las técnicas más usadas son: hibridación en fase sólida, Southern blot, Northern blot, hibridación dot-blot, hibridación con polisondas e hibridación in situ.

Conjunto de productos y utensilios suficientes para conseguir un determinado fin o realizar un procedimiento concreto de análisis, diagnóstico, detección o identificación, que se comercializan como una unidad con fecha de preparación y de caducidad. Además de los mencionados, se comercializan muchos kits para procedimientos muy diversos, como para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos, plásmidos, o diversos tests fenotípicos, secuenciación, o identificación de células viables, que son especialmente importantes en Fitopatología. Existen kits completos que permiten realizar enteramente las operaciones de diagnóstico, detección o identificación, directa o indirecta de un patógeno. En ellos se proporcionan testigos, tampones y los diversos componentes en las proporciones adecuadas, envasados de manera que se obtenga el mejor rendimiento de los componentes costosos o difíciles de obtener. Algunos componentes pueden comercializarse incluso prepesados, parcialmente prefabricados o ligados a soportes sólidos, con el fin de evitar las etapas preparativas. Existen también kits parciales que contienen únicamente los reactivos clave (anticuerpos, conjugados, sondas, iniciadores, tampones, etc.) para el fin perseguido. De cara a ser aceptados e incluidos en estándares internacionales de diagnóstico, requieren su homologación y validación.

Representación gráfica de la posición de los genes que se han localizado por métodos experimentales como la determinación del ligamiento, uso de sondas de ADN o uso de mutantes.

Método de marcado de los ácidos nucleicos para su utilización como sonda no radiactiva. Se une a la sonda un grupo que no perjudique su capacidad de hibridarse con las secuencias complementarias. Tras la hibridación, el dúplex marcado por afinidad reacciona con una molécula señal que contiene un sitio de unión para el marcador. Como moléculas señal suelen utilizarse, entre otras, anticuerpos fluorescentes o conjugados con digoxigenina, enzimas que producen cambios de color, catalizadores quimioluminiscentes, y la proteína verde fluorescente (GFP).

Técnica utilizada para marcar sondas de ADN. Se construyen dos sondas diferentes que son complementarias a segmentos adyacentes de un gen. Cada sonda lleva consigo una parte de un sistema quimioluminiscente. Al unirse las dos sondas, hibridan en la misma región y emiten luz que se puede detectar mediante el uso de un fotomultiplicador.

Distribución ordenada de cientos de miles de sondas, compuestas por moléculas de ADN de secuencia conocida inmovilizadas en un soporte sólido, frecuentemente de vidrio o nailon. Las sondas fijadas se hibridan con una solución de dianas problema de ácidos nucleicos desconocidos, que han sido previamente marcados. Las dianas son frecuentemente ADNc obtenido por transcripción inversa a partir de ARNm o generalmente ARN total. Tras la hibridación y los correspondientes lavados los híbridos que han quedado retenidos en la matriz o microchip emitirán una señal que puede ser captada e interpretada, por microscopía confocal de barrido láser u otros procedimientos. Así se obtiene una imagen característica que suele ser analizada por programas informáticos. Las sondas se pueden sintetizar directamente sobre la superficie rígida de vidrio (como en el caso de los oligonucleótidos) o se pueden preparar con anterioridad (como en el caso de oligonucleótidos, ADNc clonados, productos de PCR, etiquetas de secuencia expresada, o fragmentos génicos) y, en ese caso, se ligan posteriormente al soporte de vidrio o a una membrana de nailon.

Aquella de ADN que sirve para determinar la expresión de una serie de genes simultáneamente. Se utilizan como sondas moléculas de ADNc o pequeños fragmentos de ADNc (etiquetas de secuencia expresada o EST, de expressed sequence tags) o fragmentos génicos inmovilizados en un soporte sólido. Las dianas consisten en ADNc obtenido por transcripción inversa a partir de una muestra de ARN (normalmente ARNm) procedentes de un determinado tejido y marcados para su detección.

Denominación común de organismos procariotas del reino o dominio Bacteria (sin. Eubacteria), phylum Mycoplasmatota (previamente Tenericutes) y clase Mollicutes, que agrupa a bacterias que carecen de pared celular (por lo que son pleomórficas); en general, se distinguen de otras bacterias por ser resistentes a la penicilina y sensibles a la tetraciclina, por su elevada sensibilidad a la lisis y por su pequeño tamaño celular y de su genoma. Los mollicutes del género Mycoplasma causan enfermedades en humanos y animales, pero no en plantas, aunque se usa el nombre común micoplasma para los asociados a enfermedades de plantas. Solo colonizan el floema de las plantas infectadas y generalmente son transmitidas por insectos vectores que se alimentan de floema. Los micoplasmas patógenos de plantas pertenecen a los géneros ´Candidatus Phytoplasma´ y Spiroplasma. Fueron llamados formalmente MLO u organismos parecidos a micoplasmas y están asociados con enfermedades en cientos de especies vegetales, siendo algunas de ellas muy graves. El uso de sondas moleculares, ADN clonado y anticuerpos monoclonales, ha hecho posible clasificarlos de acuerdo a la hibridación ADN-ADN y datos serológicos. El análisis de secuencias de ADNr 16S ha revelado que el clado monofilético fitoplasma constituye un taxón coherente a nivel de género. En este clado se han delineado grupos y subgrupos, muchos de los cuales están siendo considerados como especies presuntivas bajo el estatus taxonómico provisional de ´Candidatus´ (para procariotas incompletamente descritos y no cultivables todavía en medios sintéticos in vitro). Los miembros del género Spiroplasma, con varias especies que causan graves enfermedades, se pueden obtener en cultivo in vitro y, como el agente del stubborn de los cítricos (S. citri), forman colonias en forma de huevo frito en medios sólidos.

1. Cualquier cambio ocurrido (metilación, desaminación, mutación, etc.) en los nucleótidos originales del ADN o ARN, tras su incorporación en una cadena polinucleotídica. 2. Cambio no hereditario en el fenotipo de un individuo e inducido por las condiciones ambientales. 3. Acción y efecto de modificar o transformar algo en un protocolo o estándar de diagnóstico, al cambiar alguna de sus características, reactivos o pasos, debido a mejoras validadas o al desarrollo de nuevos reactivos, sondas, técnicas o métodos.

Vesículas esféricas de lípidos ionizables, cargadas a pH ácido pero con carga neutra a pH fisiológico, que sirven como sistemas de liberación que forman estructuras nanométricas (50–200 nm) capaces de encapsular, proteger y servir de vehículo pasivo a biomoléculas como los ácidos nucleicos, proteínas o compuestos bioactivos. Las nanopartículas facilitan la entrada intracelular y la liberación dirigida de su carga pasiva. Se consideran herramientas emergentes con potencial en Fitopatología para: i) la entrega de ARN de interferencia o CRISPR/pegRNA en células vegetales o patógenos concretos, con el fin de inducir resistencia o modificar genomas sin necesidad de transgénesis estable; ii) la liberación controlada de agentes bioactivos, especialmente de péptidos antimicrobianos, inductores de defensa, compuestos antifúngicos o antibacterianos; y iii) el desarrollo de sistemas de diagnóstico rápido mediante sondas moleculares, basadas en principios físico-químicos y biotecnológicos que permiten la detección sensible y específica de patógenos, genes de interés o biomarcadores, al combinar la especificidad molecular de las sondas nucleotídicas con la estabilidad y capacidad de entrada intracelular y liberación de las nanopartículas lipídicas.

Método que permite monitorear la reacción de PCR o RT-PCR durante el proceso de amplificación, posibilitando la detección y cuantificación del organismo diana en la muestra en un único proceso realizado en placas o tubos. En teoría, hay una relación cuantitativa entre la cantidad de la secuencia diana inicial y la cantidad del producto amplificado en cualquier ciclo de la amplificación. Mediante la inclusión de fluorocromos se puede monitorizar el progreso de la reacción de amplificación en tiempo real, midiendo la fluorescencia liberada cada vez que se realiza una copia del ADN molde, puesto que el incremento de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN generado. Al permitir el seguimiento de la reacción en tiempo real, se elimina la necesidad de manipular los amplificados en pasos de post-PCR, disminuyendo riesgos de contaminación entre muestras por aerosoles. La posibilidad de poder cuantificar las dianas la convierte, además, en una herramienta útil para determinar los niveles de inóculo en la muestra. Las técnicas de amplificación molecular en tiempo real se han convertido en las de referencia para diagnóstico y detección. Para el diseño de protocolos de detección mediante PCR en tiempo real se recomienda que los productos amplificados o amplicones sean de pequeño tamaño (80-150 pb), para poder alcanzar resultados óptimos en sensibilidad, especificidad y eficiencia. La posibilidad de utilizar sondas marcadas con distintas moléculas fluorescentes permite utilizar las técnicas de PCR o RT-PCR en tiempo real en formato múltiple. Sus aplicaciones son diversas además de la detección de patógenos y determinación de la carga viral, se usan en estudios de expresión génica (cuantificación absoluta con curva patrón y cuantificación relativa con gen control endógeno), detección de SNP, o estudios de discriminación alélica, entre otras. La técnica permite procesar muestras compuestas preparadas por métodos directos, en menos de 2 h. También es muy utilizada en la versión RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR).

Método de revelado serológico de los amplicones. La PCR o la RT-PCR se realiza de manera convencional, pero el revelado se efectúa con anticuerpos. Se basa en el marcado de los iniciadores en 5’ con biotina (PCR o RT-PCR-ELISA) o en el uso de DIG-dUTP (PCR o RT-PCR-ELOSA). En el caso de la denominada PCR o RT-PCR-ELOSA los productos de PCR son hibridados con una sonda marcada con digoxigenina, previamente fijada en los pocillos de una placa de ELISA. El revelado se efectúa mediante anticuerpos antidigoxigenina marcados generalmente con fosfatasa alcalina. Estas técnicas no requieren del uso de electroforesis y el revelado puede ser automatizado, pero su sensibilidad es solo ligeramente superior a la de PCR simple convencional. Las versiones RT-PCR-ELISA y RT-PCR-ELOSA, son frecuentemente utilizadas.

En los experimentos de hibridación tipo Southern, Northern, en colonias o similares, constituye una etapa previa para bloquear los sitios de la membrana de hibridación donde no se ha unido el ácido nucleico, a fin de evitar uniones inespecíficas e indeseadas de la sonda. Se suele utilizar albúmina de suero bovino, ADN de esperma de salmón fragmentado, o leche en polvo desnatada, entre otras sustancias.

Aquella que tiene lugar entre un reactivo (anticuerpo, sonda, cebador, sustrato, etc.) y una diana distinta de la pretendida, pero similar a la que sirvió para diseñar o producir el reactivo supuestamente específico. También se denomina reactividad cruzada. En la naturaleza todo es limitado, por lo tanto, pueden coincidir por simple casualidad, además de por parentesco, secuencias, proteínas, dianas, epítopos, etc. de un patógeno con las de otro o con las de su huésped o anfitrión, otras plantas, su vector u otros. Así, un antígeno de un agente patógeno puede ser reconocido por anticuerpos desarrollados contra otro patógeno, o coincidir en toda o una gran parte de la secuencia empleada para diseñar una sonda o un cebador, con la secuencia de otro agente patógeno o incluso del huésped o de otro organismo. Las reacciones cruzadas son específicas, aunque generalmente indeseadas, salvo en casos en los que se desee establecer y valorar el parentesco inmunológico, bioquímico o de secuencias, entre distintas dianas.

Sustancia que se emplea para provocar una reacción química o que produce una reacción. En un sentido más amplio, sustancia que, por su capacidad de provocar determinadas reacciones, sirve en los ensayos y análisis químicos, bioquímicos, inmunológicos o serológicos, de hibridación molecular y de amplificación molecular, para revelar la presencia (detectar) o medir la cantidad de otra sustancia o diana (cuantificar), como son enzimas, anticuerpos, sondas, iniciadores, etc.

Producto químico, tampón, enzima, anticuerpos, sonda, cebadores, etc., usados para el diagnóstico, detección o identificación de agentes fitopatógenos o como componente de un kit de diagnóstico.

Lugar donde se guarda algo, o archivo donde se almacenan recursos digitales o de otro tipo, de forma que estos sean accesibles a través de internet o correo ordinario (bibliografía, colecciones, datos de secuencia, documentos, plantas, semillas, etc.). Existen tres tipos fundamentales: i) institucionales (creados por las organizaciones para depositar, usar y preservar la producción científica y académica que generan); ii) temáticos (los creados por un grupo de investigadores, una institución, etc. que reúnen únicamente documentos o material relacionados con un área temática específica o proyecto concreto); y iii) de datos (almacenan, conservan y comparten datos de investigaciones, material vegetal seleccionado o coleccionado, productos, reactivos como anticuerpos, sondas, microorganismos, testigos positivos/negativos, etc. o bien información general en torno a especificidad, sensibilidad u otros parámetros de diagnóstico útiles para la detección, diagnóstico e identificación de agentes patógenos.

Sistema muy utilizado en biología como marcador en numerosos métodos de detección de proteínas y ácidos nucleicos. La unión no covalente biotina-avidina es muy estable. La constante de afinidad del complejo biotina-avidina es de 1015 M-1, una de las más altas conocidas (como referencia, la afinidad entre antígeno y anticuerpo suele ser de alrededor de 1012 M-1). La estreptavidina es la proteína marcadora de uso más habitual ya que es no glicosilada y muestra niveles bajos de unión inespecífica y ha sustituido a la avidina que es una glicoproteína altamente catiónica y puede producir coloración de fondo inespecífica en algunas aplicaciones, debido a sus residuos cargados positivamente y componentes de oligosacáridos. El sistema es muy utilizado y hace posible que el uso de moléculas (frecuentemente anticuerpos) o compuestos biotinilados sean revelados con estreptavidina marcada o conjugada con enzimas, oro coloidal, hierro, fluorocromos, etc. o cualquier sustancia o elemento delator. El sistema es utilizado en técnicas ELISA, citometría de flujo, inmunotransferencia, inmunohistoquímica, inmunoelectromicroscopía de decoración, adquisición de imágenes fluorescentes, sondas de ADN para hibridación Southern o in situ, o detección en general. También se usan resinas y gránulos magnéticos de estreptavidina conjugada para aislar proteínas, células y ADN, o en separación biológica.

1. Región o zona de un patógeno o sus metabolitos, elegida para producir o diseñar herramientas o reactivos apropiados para su diagnóstico universal (sitios conservados) o específico o para su inactivación efectiva por medio de pesticidas o agentes de biocontrol. 2. Región de la secuencia que se utiliza en el diseño de sondas o cebadores, ya sea por su especificidad o por representar una secuencia conservada y, por tanto, apta para un diagnóstico universal. 3. Epítopo o determinante antigénico elegido para diagnóstico selectivo o universal, por medio de anticuerpos, generalmente monoclonales o recombinantes producidos frente al mismo, ya sea natural (purificado) o sintético (generalmente péptidos).

Nombre comercial de una sonda de hidrólisis diseñada con el fin de incrementar significativamente la especificidad de la PCR cuantitativa, mediante tecnología de la compañía Roche. Contiene un fluoróforo emisor y un colorante supresor o extintor muy próximos el uno del otro, y cuando la sonda está intacta, el extintor suprime la señal fluorescente del emisor. Durante la PCR, la polimerasa rompe la sonda, separando el emisor y el extintor, permitiendo emitir fluorescencia. Por tanto, el supresor inhibe la fluorescencia del fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del termociclador. De esta forma, mientras que el fluoróforo y el supresor o extintor estén próximos el uno al otro, no habrá señal fluorescente, puesto que el último está ejerciendo su actividad inhibidora.

Denominación común de la transferencia tipo Northern, hibridación realizada sobre los fragmentos de ARN transferidos a una membrana, mediante un proceso análogo al de transferencia Southern, pero de ARN. El análisis Northern se usa para identificar las cadenas de ARN (total, mensajero, vírico, etc.) de secuencia semejante al ADN que se utiliza como sonda, tras separación por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (en presencia de formaldehído) y transferencia a una membrana. A diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN y realizar estudios de expresión génica, para conocer qué genes están activos formando ARNm en qué condiciones y en qué tejidos o tipos celulares.