Diccionario

Denominación común de la hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN), que en el campo de la Patología Vegetal se aplica con frecuencia a la detección e identificación de patógenos de vegetales. Su potencial como herramienta de diagnóstico se demostró primero para la detección de viroides y posteriormente para virus. Asociación de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar una cadena doble que contenga dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una de ADN y una de ARN. Se emplea para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Se basa en la interacción específica entre las bases púricas y pirimidínicas complementarias que forman pares A-T y G-C, lo que resulta en un híbrido estable formado por parte, o la totalidad, de la secuencia del ácido nucleico del patógeno a detectar (molécula diana) y en la secuencia complementaria marcada (sonda). La estabilidad del híbrido depende del número de enlaces de hidrógeno formado y de las fuerzas electrostáticas e hidrófobas. Las fuerzas electrostáticas son debidas a las moléculas de fosfato del esqueleto del ácido nucleico, mientras que las interacciones hidrofóbicas se mantienen entre las bases apiladas. La detección de agentes fitopatógenos, como los virus, se realiza mediante la unión del ácido nucleico del genoma viral con moléculas de ácido nucleico complementario (sonda), que han sido marcadas con un isótopo radiactivo u otra molécula no radiactiva, como la biotina, avidina, proteína A, digoxigenina, proteína verde fluorescente-GFP, etc., que permite detectar, localizar, incluso valorar de forma cuantitativa, la hibridación ocurrida. Los principales factores que afectan a la reacción de hibridación son: la longitud y la composición de bases de la sonda, la temperatura, la concentración de sales, el pH, la concentración de formamida y el grado de identidad entre muestra y sonda. Las técnicas más usadas son: hibridación en fase sólida, Southern blot, Northern blot, hibridación dot-blot, hibridación con polisondas e hibridación in situ.

1. Segmento de ARN con nucleótidos complementarios de un ARN mensajero, que se une a él evitando que se traduzca la proteína codificada por dicho ARN mensajero, regulando así la expresión génica. 2. Molécula de ARN (sintética o natural) sintetizada in vitro que servirá de sonda en experimentos de hibridación molecular.

También denominada vitamina H, vitamina B7, vitamina B8 (aunque este nombre también se ha asignado a otros compuestos) o coenzima R, es una vitamina soluble en agua. Juega un papel relevante en el metabolismo de carbohidratos, proteínas y grasas. Es muy utilizada como marcador para revelar reacciones inmunológicas o serológicas, y en hibridación molecular para localizar secuencias de ADN in situ gracias a su gran avidez por la avidina, que puede estar marcada o conjugada con sustancias o productos delatores.

Esteroide que se encuentra exclusivamente en las flores y las hojas de las especies Digitalis purpurea, D. orientalis y D. lanata. Es un hapteno que se utiliza frecuentemente como molécula señal o marcador en inmunología e hibridación molecular, para el revelado de reacciones como otros marcadores (biotina o fluoresceína). Habitualmente, la digoxigenina se introduce químicamente por conjugación, en biomoléculas (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos) para ser detectados en ensayos adicionales. Son muy populares los anticuerpos anti-digoxigenina, ya que se utilizan en una extensa gama de ensayos inmunológicos como ELISA, electrotransferencias, etc. e hibridaciones moleculares e hibridación in situ y confieren gran sensibilidad a la reacción. De hecho, el uso de precursores no radiactivos para marcar ácidos nucleicos ha hecho a la hibridación molecular más accesible. El precursor no radioactivo más utilizado son los derivados de la molécula DIG, que está unido a través de un brazo espaciador (once residuos de carbono) a uridín-nucleótidos, y se incorpora enzimáticamente en los ácidos nucleicos mediante métodos estándar.

Denominación común en hibridación molecular para referirse a las moléculas sonda-muestra.

Proceso de incremento artificial de las células bacterianas presentes en un extracto o dilacerado de una muestra, mediante adición de un medio de cultivo líquido, preferiblemente semiselectivo o selectivo de la bacteria diana, e incubación adecuada. El enriquecimiento aumenta la sensibilidad de detección de técnicas de aislamiento, inmunológicas (inmunofluorescencia o ELISA), de hibridación molecular y de amplificación molecular (PCR y PCR en tiempo real). Su ventaja es que permite detectar células viables. Se puede aplicar a microorganismos que puedan ser cultivados in vitro.

Término usual en laboratorio, a pesar de que no está reconocido por la RAE. Expresa las condiciones a las cuales se desarrolla la hibridación molecular y la detección del dúplex. La estringencia (rigor o fuerza) y la estabilidad de los complejos híbridos formados, determinan la especificidad de la formación de híbridos. A temperaturas más altas y menor concentración de sal, en general se incrementa la estringencia de la hibridación. Es conveniente utilizar formamida en la solución de hibridación para favorecer un correcto apareamiento de bases y al mismo tiempo disminuir las reacciones inespecíficas. Para la detección de virus de ARN, las hibridaciones se llevan a cabo a 65-68 °C, mientras que para los viroides una buena relación de señal/fondo se consigue a 70-72 °C en 50 % de formamida. Baja estringencia permite mayor cantidad de hibridación pero con menor especificidad (baja temperatura, alta concentración de sales). Alta estringencia implica menor cantidad de hibridación, pero mayor especificidad Los factores que afectan la estringencia son temperatura, concentración de sales, las bases no complementarias y la longitud del fragmento.

Amida derivada del ácido fórmico, también conocida como metanamida, que impide la neutralización de los grupos fosfato de la molécula por sales de sodio y magnesio; al ser los grupos fosfato de marcado carácter negativo, su repulsión causa la separación física de las hebras y, por tanto, su desnaturalización. Es utilizada en técnicas de hibridación molecular ya que impone una condición de alta astringencia, permitiendo solo uniones de gran complementariedad.

Procedimiento para la detección simultánea de varias secuencias mediante la utilización de una sonda múltiple capaz de reconocer a un número variable de secuencias nucleotídicas, mediante hibridación molecular. El sistema supone la clonación en tándem de varios fragmentos genómicos distintos en un mismo vector plasmídico lo cual permite la síntesis en la misma reacción de transcripción, de una única sonda de ARN o ADN.

Aquella en la que se inmoviliza el ADN o ARN de la muestra desnaturalizado sobre un soporte sólido o filtro, de forma que se impide la autohibridación, que puede ocurrir en medio líquido. Seguidamente se introduce el soporte en una solución con sondas de ácidos nucleicos complementarios y marcados con una molécula delatora. Tras la hibridación y lavado para eliminar los productos que no hayan reaccionado, los híbridos se detectan por autorradiografía, caso de sondas marcadas con 32P o, en la actualidad más frecuentemente, por variados métodos inmunoenzimáticos disponibles. Es la modalidad de hibridación molecular más común que implica la aplicación de una solución de ácido nucleico a un soporte sólido, tal como membranas de nitrocelulosa o de nailon, y la posterior detección con sondas específicas apropiadas.

Aparato muy común para la preparación de extractos de muestras biológicas de suelo o de tejidos vegetales, de extractos previa a análisis serológicos, moleculares o de amplificación molecular, estudio de proteínas, ácidos nucleicos o de agentes patógenos, células, metabolismo celular, etc. Estos aparatos tratan de disgregar los tejidos y romper las células, dañando lo menos posible la membrana plasmática. La preparación de la muestra puede generarse en el homogeneizador mediante fuerzas de cizalladura producidas por líquidos (homogeneizadores de vástago), mediante fuerzas de cizalladura producidas por sólidos (mortero y mazo, bolsas de malla fina con homogeneizadores de rodamientos manuales o incluso semiautomáticos como el extractor Tecan, o con bolsas de malla gruesa con martillo, prensa de rodillos lisos o acanalados, extractor de Gugerli, molinos de bolas, molinillos de aspas, batidoras-trituradoras), mediante cavitación gaseosa (bomba de nitrógeno, generadores de ultrasonidos) o mediante medios químicos o bioquímicos (medio hipotónico, rotura celular con lisozima). Es preciso utilizar sistemas que minimicen la contaminación cruzada, la generación de aerosoles y que reduzcan el ruido, como la preparación de homogeneizados en bolsas de plástico, que pueden ser estériles y provistas de malla fina filtrante o gruesa que ayude en la trituración de material leñoso. Los más utilizados para análisis serológicos y de hibridación molecular son los homogeneizadores de vástago, extractor de Gugerli (para patata o papa) y los de rodamientos en bolsas. Para análisis por amplificación molecular los más usuales son los homogeneizadores Homex 6 y el homogeneizador manual de rodamientos, ambos en bolsas. Los robots capaces de homogeneizar gran número de muestras de tejidos vegetales, manteniendo los extractos a baja temperatura y extrayendo el ADN, previo a la amplificación por PCR en tiempo real, son cada vez más usados por ser muy útiles para el análisis de gran número de muestras de prospecciones masivas.

Marca comercial de instrumento de laboratorio que permite la realización casi automática de homogeneizados de material vegetal suculento (hojas, flores, peladuras de frutos, raicillas, o brotes herbáceos) en bolsas de plástico de preparación de extractos. Permite el tratamiento consecutivo de varias bolsas con muestra (hasta ocho) pudiendo regular el tiempo de funcionamiento en cada muestra y la velocidad de giro de los rodillos de rodamientos. Un operador puede procesar unas 250 muestras por hora, utilizables para técnicas ELISA, de hibridación molecular o de amplificación molecular por PCR. El sistema evita la contaminación cruzada entre muestras.

1. Detención o descenso del crecimiento, replicación o multiplicación de microorganismos. 2. Reducción de la tasa máxima de una reacción química por inhibición no competitiva. 3. Ausencia o bajo rendimiento de una hibridación molecular o de la reacción de amplificación molecular por contaminantes orgánicos (frecuentemente del propio material vegetal o del vector) o inorgánicos incluidos en la muestra y que no se han eliminado en la extracción del ADN o ARN. Se puede detectar su acción utilizando un control interno.

Prueba analítica basada en la alta especificidad de la interacción entre un anticuerpo y un antígeno. La medida de la interacción puede ser cuantitativa o semicuantitativa. La mayoría en Fitopatología se basan en técnicas ELISA o de inmunofluorescencia (o históricamente en aglutinación e inmunodifusión), o colaboran con técnicas de hibridación molecular o de amplificación molecular, para la captura de dianas o el revelado de la reacción.

Procedimiento que se sigue en ciencia para hallar la verdad y enseñarla. El método científico se refiere a la serie de etapas o conjunto de técnicas y procedimientos, para obtener un conocimiento válido desde el punto de vista científico, utilizando para ello instrumentos que resulten fiables. Este sistema minimiza la influencia de la subjetividad. En Patología Vegetal los métodos de detección, diagnóstico e identificación incluyen: bioensayos, métodos bioquímicos, métodos de tipado genético, de aislamiento/extracción, hibridación molecular, amplificación molecular, métodos morfológicos y morfométricos, evaluación de la patogenicidad, microscopía óptica y electrónica, y métodos inmunológicos o serológicos. También diversos métodos químicos y técnicas analíticas.

Alternativa a la mezcla de diferentes ribosondas para la detección múltiple basada en la hibridación molecular no isotópica. Esta estrategia consiste en la clonación en tándem de secuencias de ácido nucleico parciales de diferentes virus para permitir la síntesis de una ribosonda única. Se diseñó inicialmente para la detección simultánea de seis virus de frutales de hueso o carozo, y posteriormente para virus de tomate, virus y viroides de frutales y viroides de ornamentales, vid y frutales. La opción del uso de polisondas ofrece varias ventajas: i) solamente se necesita una reacción de síntesis para un gran número de virus/viroides, con el consiguiente ahorro de tiempo y costes, evitando así la variabilidad potencial en la eficiencia de las diferentes ribosondas; ii) a diferencia de la mezcla de ribosondas diferentes, esta estrategia no requiere el tratamiento con RNasa, necesario para evitar el fondo observado cuando altas cantidades de sondas de ARN-DIG están presentes en la solución de hibridación, y permite así la detección tanto de virus de ADN como de ARN en el mismo ensayo; y iii) posibilita el diseño de una “polisonda cultivo” específica para detectar diferentes virus/viroides y otros patógenos que afecten a un mismo cultivo.

Sustancia que se emplea para provocar una reacción química o que produce una reacción. En un sentido más amplio, sustancia que, por su capacidad de provocar determinadas reacciones, sirve en los ensayos y análisis químicos, bioquímicos, inmunológicos o serológicos, de hibridación molecular y de amplificación molecular, para revelar la presencia (detectar) o medir la cantidad de otra sustancia o diana (cuantificar), como son enzimas, anticuerpos, sondas, iniciadores, etc.

Molécula de ADN marcada (con 32P, 35S, estreptavidina, biotina, proteína A, proteína verde fluorescente, etc.), utilizada para detectar moléculas de ácidos nucleicos de secuencia complementaria por medio de hibridación molecular.

Solución química resistente a los cambios de pH cuando se añaden ácidos o bases. Generalmente los basados en sales inorgánicas (fosfatos, carbonatos) y sales de ácidos orgánicos (acetato, barbiturato, borato, citrato, glicina, maleato, succinato, etc.) son los más comunes en laboratorios de Fitopatología. Además, los sistemas tampón in vivo son esenciales para mantener el pH fisiológico del citoplasma y de los fluidos extracelulares; el tampón fosfato es el principal tampón intracelular mientras que el tampón bicarbonato es el principal tampón extracelular. Los tampones son muy importantes en los protocolos de aislamiento de las partículas subcelulares, enzimas, proteínas y ácidos nucleicos. Se utilizan también en electroforesis, cromatografía y técnicas de detección (serológicas, hibridación molecular, amplificación molecular, transferencias, secuenciación, etc.).

1. Proceso de unión de dos hebras de ácido nucleico por complementariedad de base, como el apareamiento de dos hebras de ADN para formar una doble hélice. Esta técnica se utiliza para detectar, localizar o identificar secuencias de nucleótidos, así como para establecer una transferencia eficaz de material genético a un nuevo huésped o anfitrión. 2. (hybridisation, hybridization). Cruce o apareamiento entre dos individuos genéticamente diferentes (que difieren en una o más características hereditarias).